PKCα在VIIa-TF/PAR2促进SW620细胞增殖、迁移与生存中的作用探讨

摘要

目的:在结肠癌SW620细胞系中，探讨proteinkinaseCα(PKCα)在TF-Vlla-PAR2信号转导轴中是否被激活以及其在结肠癌细胞株增殖、迁移与生存中的作用;进一步分析该过程中PKCα的下游信号分子及其调控的效应分子，以阐明TF-Vlla-PAR2-PKCα促进SW620细胞增殖、迁移与生存的分子机制。
　　 方法:(1)采用因子VIla(10nM)、PAR2激动剂（PAR2-AP，100μM）以及PKC激动剂佛波酯(PMA，100nM)等处理SW620细胞不同时间，westernblot检测其PKCα与p-PKCα的表达，免疫荧光试验观察PKCα的分布情况。(2)借助抑制抗体（α-TF、α-PAR2）、同型对照抗体(mopc-21)、PKCα抑制剂（safingol，10μM）及ERK1/2抑制剂(U0126，10μM)进行抑制试验，westernblot检测其PKCα与p-PKCα，ERK1/2与p—ERK1/2以及NF-κB与p-NF-κB的表达，探讨PKCα上下游的信号分子。(3)采用PMA(100nM)、Vlla(10nM)及PKCα抑制剂(safingol,10μM)等不同组合刺激SW620细胞后，MTT探测细胞增殖能力，Transwell试验检测细胞迁移潜能，流式细胞术(FCM)评估细胞的生存能力。(4)采用Vlla(10nM)、PKCα抑制剂（safingol,10μM）以及NF-κB抑制剂(PDTC，5μM)等不同组合刺激SW620细胞后，实时荧光定量PCR与westernblot检测MMP-9，caspase-3，TF，与Bcl-2/Bax的表达，TF活性检测试剂盒检测TF活性。
　　 结果:(1)与medium组比较，Vlla(10nM)、PAR2-AP(100μM)及PMA(100nM)均能明显促进PKCα的磷酸化，而对PKCα的表达没有显著性影响。免疫荧光结果表明，medium组PKCα主要分布在胞浆，分布无明显规律，核内未探测到PKCα的表达;Vlla、PAR2-AP、PMA处理组的PKCα主要分布在核周，并且核内亦有少量表达。(2)与medium组比较，抗TF或抗PAR2抗体均能明显减弱VIla与PAR2-AP诱导的p-PKCα的表达(p＜0.05)，而同型对照抗体（mopc-21）则没有这种抑制效果(P＞0.05)。与Vlla处理组比较，PKCα抑制剂（safingol，10μM）能显著抑制Vlla对下游信号分子ERK1/2及NF-KB的磷酸化(p＜0.05)。(3)与medium组比较，Vlla(10nM)及PMA(100nM)均能明显促进细胞的增殖、迁移与生存(p＜0.05);这一促进增强作用能被PKCα抑制剂(safingol，10μM)阻断(p＜0.05)。(4)与medium组比较，Vlla(10nM)能诱导caspase-3与Bax表达明显下调，MMP-9、TF与Bcl-2表达以及TF活性明显上调，这一诱导作用能被PKCα抑制剂(safingol，10μM)与NF-κB抑制剂(PDTC，5μM)阻断(p＜0.05)。
　　 结论:(1)在结肠癌细胞株SW620中，PKCα能够被因子Vlla与PAR2-AP激活。
　　 (2)Vlla依赖TF及PAR2激活PKCα，进而活化下游的ERK1/2与NF-κB。
　　 (3)PKCα激活对于因子Vlla促进SW620细胞的增殖、迁移与生存是非常必要的。
　　 (4)PKCα激活参与了因子Vlla诱导的MMP-9、caspase-3、TF与Bcl-2/Bax效应分子表达。

目录

声明

摘要

主要缩略词表

第一章 绪论

1．1 TF与PAR2

1．1．1 TF的结构与功能

1．1．2 PAR2的结构及分布

1．1．3 PAR2的活化及失活

1．1．4 TF-Ⅶa与PAR2

1．1．5 Ⅶa-TF／PAR2信号转导与肿瘤

1．2 PKCα与PAR2

1．2．1 PKC

1．2．2 PKCα与肿瘤

1．2．3 PKCα与PAR2

1．3 PKC α／ERK1／2／NF-κB信号通路与PAR2

1．3．1 ERK1／2

1．3．2 NF-κB

1．3．3 PKC α与ERK1／2／NF-κB

1．3．4 ERK1／2／NF-κB与PAR2信号通路

1．4 细胞凋亡与肿瘤

1．4．1 细胞凋亡途径

1．4．2 Caspase-3

1．4．3 Bcl-2／Bax

1．5 细胞侵袭和转移与肿瘤

1．5．1 MMP-9

1．5．2 MMP-9与肿瘤

1．6 结语

1．7 本论文研究的目的、方法、实验方案的设计、意义

1．7．1 研究目的

1．7．2 研究方法和技术

1．7．3 实验方案和设计

1．7．4 研究意义

第二章 Ⅶa-TF／PAR2激活对细胞PKCα通路的影响

2．1 材料和试剂

2．1．1 材料

2．1．2 主要试剂及其配置

2．1．3 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 Western blotting检测细胞PKCα／ERK1／2／NF-κB蛋白表达情况

2．2．3 免疫荧光染色

2．2．4 数据处理与统计

2．3 结果

2．3．1 Ⅶa与PAR2-AP诱导SW620细胞株的PKCα的活化

2．3．2 Ⅶa依赖TF及PAR2激活PKCα

2．3．3 Ⅶa经PKC α介导激活下游的ERK1／2与NF-κB

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 PKCα抑制剂对Ⅶa-TF-PAR2促细胞增殖迁移生存效应的干预

3．1 材料和试剂

3．1．1 材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 细胞培养

3．2．2 MTT法检测细胞的增殖能力

3．2．3 Transwell试验检测细胞迁移能力

3．2．4 流式细胞仪分析细胞凋亡

3．2．5 数据处理与统计

3．3 结果

3．3．1 PKCα抑制剂阻断了Ⅶa诱导的SW620细胞的增殖、迁移与生存

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 PKCα促进细胞增殖、迁移与生存的分子机制的探讨

4．1 材料与仪器

4．1．1 主要材料

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 方法

4．2．1 细胞培养

4．2．2 Western blotting检测Bcl-2与Bax蛋白表达

4．2．3 Xa生成法检测TF活性

4．2．4 实时荧光定量PCR检测细胞TF、MMP-9与caspase-3的mRNAs表达

4．2．5 数据处理与统计

4．3 结果

4．3．1 PKCα抑制剂反转Ⅶa诱导的caspase-3、MMP-9与TF mRNAs表达以及TF活性的上调与Bcl-2／Bax蛋白表达

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 主要结论、学术创新与展望

5．1 主要结论

5．2 学术创新

5．3 展望

参考文献

致谢

读博期间发表论文，参加课题