苦瓜籽提取物诱导HepG2细胞凋亡的机制研究

摘要

苦瓜籽富含油脂、蛋白质、多酚、皂苷等多种活性成分，具有抗菌、抗氧化、改善糖尿病以及抗癌等多种药用价值。miRN A存在于所有生物体中，具有转录后水平的负调控作用，是各种机体活动中的关键调控因子。大量流行病学及临床研究证明，饮食是影响健康与疾病的一个重要可调控因素，本研究以miRN A为入手点，探讨苦瓜籽水提物的抗肿瘤机制，为癌症的治疗提供新的食源性天然抗癌食品，并开辟新的治疗靶点。
　　本文对苦瓜籽的主要成分进行了深入分析，对抗癌活性蛋白进行了分离、纯化和鉴定；以HepG2细胞为主要作用对象，评价干预前后HepG2细胞在生长增殖、细胞周期、ROS、线粒体膜电位、细胞核形态等生物学特性方面的差异性，初步分析苦瓜籽水提物诱导癌细胞凋亡的作用；以miR-421为主要的研究对象，探讨了苦瓜籽水提物诱导HepG2细胞凋亡的机制。论文主要研究结果如下：
　　1.苦瓜籽主要成分分析及抗癌活性蛋白分析
　　苦瓜籽主要成分是油脂和蛋白质，含量分别为44.44±0.17%和34.83±0.47%，总糖含量为11.88±0.04%；另外，还含有2.27±0.17%的皂苷和1.03±0.08%的多酚。当硫酸铵饱和度在30%-60%的时候，苦瓜籽粗蛋白的提取率最高，蛋白种类最多，并且抗肿瘤活性最强；经过CM-Sepharose FF弱阳离子柱纯化苦瓜籽蛋白，共洗脱出6个蛋白峰和1个穿透峰，其中穿透峰1的蛋白主要富集在30KD以下，并具有显著的抗肿瘤活性；进一步采用Q exactive质谱对穿透峰1进行蛋白定性分析，发现穿透峰1的主要蛋白成分是核糖体失活蛋白和胰蛋白酶抑制剂。
　　2.苦瓜籽水提物诱导细胞凋亡的机制研究
　　苦瓜籽水提物可以显著抑制HepG2、SGC-7901和HT-29细胞的增殖，并呈剂量依赖性，IC50值分别为586.27±0.07μg/mL、771.09±0.08μg/mL与1206.17±0.08μg/mL，其中苦瓜籽水提物对HepG2细胞的抑制作用最为显著；苦瓜籽水提物能够将HepG2细胞周期阻滞在S期，并促进ROS含量的产生，降低线粒体膜电位，影响蛋白表达，最终破坏细胞正常形态与结构，导致细胞核涣散甚至破碎，产生大量凋亡小体。
　　3.苦瓜籽水提物通过下调miR-421诱导HepG2凋亡的机制
　　苦瓜籽水提物可以显著改善4个癌症相关miRNA的表达，其中miR-421和miR-23b-3p表达量显著下调，miR-138-1-3P和miR-190b表达量显著上调。以miR-421及miR-138-1-3P为对象，结合生物信息学分析和靶基因芯片技术，并通过RT-PCR验证，发现有9个miR-421靶基因在苦瓜籽水提物诱导凋亡的 HepG2细胞中表达上调；成功转染miR-421 mimics和miR-421 inhibitor，并观察miR-421可疑靶基因Caspase-3和DUSP6的变化，结果发现miR-421过表达时，Caspase-3基因表达量和蛋白表达量均显著下调，但是DUSP6蛋白表达量无显著变化，说明苦瓜籽水提物可能是通过下调 miR-421，上调下游基因Caspase-3的表达，从而诱导HepG2细胞凋亡。

目录

声明

第一章 绪 论

1.1 苦瓜籽的国内外研究现状

1.2 miRNA的研究现状

1.3研究的目的和意义

1.4主要研究内容

第二章 苦瓜籽主要成分及抗癌活性蛋白分析

2.1引言

2.2试验材料

2.3试验方法

2.4结果与分析

2.5小结与讨论

第三章 苦瓜籽水提物诱导细胞凋亡的机制研究

3.1引言

3.2试验材料

3.3试验方法

3.4结果与分析

3.5小结与讨论

第四章 苦瓜籽水提物下调miR-4 2 1诱导He pG2凋亡的机制

4.1引言

4.2试验材料

4.3试验方法

4.4结果与分析

4.5小结与讨论

第五章 结论与展望

5.1主要结论

5.2展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文及其他科研成果