解脂亚罗酵母Y-2降解赭曲霉毒素A机制的研究

摘要

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）主要由青霉属（Penicillium）和曲霉属（Aspergillus）真菌产生，是葡萄及其制品中最重要的真菌毒素污染物之一，能够对人和动物的健康产生巨大威胁。因此，必须采取合适的方法控制葡萄及其制品中的OTA。采用拮抗酵母控制及降解葡萄及其制品中的OTA因具有安全、高效等优点而逐渐受到国内外研究人员的重视，但有关拮抗酵母降解OTA的机制，尤其是分子机制尚不明确，需要进一步的研究。 我们课题组前期分离筛选到一株解脂亚罗酵母Y-2（Yarrowia lipolytica Y-2），对红提葡萄由Talaromyces rugulosus O1引起的采后病害有良好的控制效果，且可以体外降解 OTA，根据试验结果推测其降解是由于胞内酶的作用。但该拮抗酵母对不同品种葡萄上 OTA 的控制作用以及降解 OTA 的分子机制还不明确，需要进一步研究。本论文从Y. lipolytica Y-2对不同品种葡萄上OTA的控制作用、Y. lipolytica Y-2胞内酶对OTA的降解作用及其蛋白鉴定和分析以及胞内酶降解OTA的产物及其毒性几个方面进行研究，揭示Y. lipolytica Y-2降解OTA的机制。论文的主要研究结果如下： 1. 通过体内试验研究了Y. lipolytica Y-2对不同品种葡萄上OTA的控制作用。结果表明，该拮抗酵母能够抑制由T. rugulosus O1引起的不同品种葡萄的腐烂，从而降低葡萄伤口处OTA的含量，且酵母浓度越高，OTA积累量越低；在葡萄贮藏过程中该酵母对OTA积累均具有显著的控制作用。 2. 通过体外试验研究了Y. lipolytica Y-2胞内酶对OTA的降解作用。结果表明，经OTA诱导和未诱导的Y. lipolytica Y-2胞内酶、胞内酶的不同饱和度硫酸铵分级沉淀物对OTA均具有降解作用，且55%-65%饱和度硫酸铵分级沉淀物对OTA的降解效率最高，2 h 时，降解率高达91%。 3. 以不降解 OTA 的 Y. lipolytica Polh 为对照，利用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术并结合生物信息学技术，对 55%-65%饱和度硫酸铵沉淀的Y. lipolytica Y-2胞内酶的蛋白进行了鉴定和比较分析，推测Y. lipolytica Y-2中的羧肽酶直接参与OTA的降解；与能量代谢相关的蛋白如琥珀酰-CoA连接酶、三磷酸腺苷合成酶，与细胞氧化应激相关的蛋白如过氧化物酶、Cu/Zn-超氧化物歧化酶、黄素蛋白、谷胱甘肽、谷胱甘肽合成酶、谷胱甘肽-S-转移酶，谷胱甘肽过氧化物酶等参与Y. lipolytica Y-2对OTA引起的氧化胁迫的响应。 4. 利用薄层层析（ TLC ）、高效液相色谱（ HPLC-FLD ）和液质联用（HPLC-PDA-MS）检测技术，对Y. lipolytica Y-2胞内酶降解OTA的产物进行鉴定，并考察了产物对HEK293细胞的毒性。Y. lipolytica Y-2胞内酶降解OTA的主要产物为OTα，产物OTα对HEK293细胞的毒性低于OTA。

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