食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇胶体金免疫快速检测技术研究

摘要

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是单端孢霉烯族毒素之一，广泛存在于谷物和饲料中，严重危害人类和动物的健康。目前的检测方法操作繁琐，大多需要专门的仪器进行配套检测，无法满足快速、简便、现场检测的要求。本文以多克隆抗体和胶体金合成标记技术为基础，根据免疫层析的原理，建立了食品中DON胶体金免疫快速检测方法。 通过DCC法合成DON完全抗原，DON与BSA的初始摩尔比为50：1，得到DON完全抗原中DON与BSA的摩尔比为9.7：1。通过红外光谱扫描以及ELISA实验验证了DON—BSA的偶联成功。将DON—BSA免疫新西兰大白兔，得到抗体的最高效价为12800，抑制率IC50为10Vg/mL，与T-2毒素、NIV的交叉反应率分别为9.1％，4.9％。 采用柠檬酸三钠还原法成功制备了粒径为10nnl和20nm的胶体金，并在紫外图谱上进行了表征。胶体金标记抗体的最适pH为9.0，最适抗体加入量为0.066mg/mL、0.072mg/mL。胶体金标记抗血清得到免疫胶体金探针，胶体金、抗体溶液、免疫探针复合物做紫外扫描，280nm附近有蛋白特征峰出现，与胶体金复合后，原出现在520nin处的胶体金的特征峰，峰值增高，并平移至540nm附近，证明大分子蛋白抗体与胶体金偶联成功。 标记前后的抗体蛋白红外光谱扫描的结果表明，标记前后抗体蛋白的特征基团结构没有发生明显的变化。对抗体探针进行荧光光谱扫描分析，胶体金对抗体蛋白的内源荧光有猝灭作用，并且随着胶体金浓度的增加，抗体的荧光强度呈现有规律的降低，发射光的位置不变。 以胶体金标记多克隆抗体作为探针，DON—BSA作为竞争抗原，构建了胶体金免疫检测体系(GICA)。确定最佳包被抗原浓度为10μg/mL，缓冲液体系：10％甲醇+0.05％吐温20的pH7.4PBS溶液，胶体金的最佳粒径20nm左右。GICA目测检出限为1mg/kg，检测时间为10～15min。方法的重复性良好。方法的稳定性良好，试纸条室温保存3个月，4℃保存6个月。对自然污染的样品进行ELISA和GICA检测，结果证明两者有良好的一致性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1脱氧雪腐镰刀菌烯醇简介

1.1.1脱氧雪腐镰刀菌烯醇的发现、命名及其结构

1.1.2 DON的理化性质

1.2 DON的毒性及其作用机理

1.2.1 DON的致呕吐作用

1.2.2 DON的急性毒性

1.2.3 DON的慢性毒性

1.2.4 DON的细胞毒性

1.2.5 DON的皮肤毒性

1.2.6 DON的遗传毒性

1.2.7 DON的免疫毒性

1.2.8 DON的三致(致癌、致畸、致突变)作用

1.3 DON的污染情况

1.4 DON的检测

1.4.1薄层色谱法(TLC)

1.4.2高效液相色谱法(HPLC)

1.4.3气相色谱法(GC)

1.4.4酶联免疫吸附测定法

1.4.5目前的各种检测方法的比较

1.5胶体金免疫检测技术研究进展

1.5.1胶体金简介

1.5.2纳米金溶胶免疫技术的兴起

1.5.3纳米金溶胶合成及标记技术的简介

1.6本课题的意义及主要研究内容

1.6.1立题背景及意义

1.6.2论文主要研究内容

第二章脱氧雪腐镰刀菌烯醇完全抗原的制备与鉴定

2.1引言

2.2实验材料与仪器

2.2.1实验材料

2.2.2实验主要仪器

2.3实验方法

2.3.1 MBSA(modifled bovine serum albumen)的制备

2.3.2 DON的衍生化

2.3.3LC／MS鉴定DON衍生物

2.3.4 DON完全抗原的构建(免疫抗原)

2.3.5红外光谱鉴定完全抗原结构

2.3.6偶联比的测定

2.3.7抗呕吐毒素抗体效价测定

2.4结果与分析

2.4.1 DON的衍生化

2.4.2 DON完全抗原的结构鉴定

2.4.3偶联比的计算

2.4.4抗血清效价的确定

2.5讨论

2.6本章小结

第三章抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体的制备与鉴定

3.1引言

3.2实验材料

3.2.1材料和试剂

3.2.2仪器设备

3.2.3主要溶液

3.3实验方法

3.3.1抗血清的制备

3.3.2抗血清的分离与保存

3.3.3抗血清的纯化

3.3.4最佳包被浓度以及抗体稀释度的确定

3.3.5抗呕吐毒素抗体效价的测定

3.3.6抑制浓度IC50的测定

3.3.7交叉反应率的测定

3.4结果与分析

3.4.1抗原最佳包被浓度和抗体最佳工作浓度的确定

3.4.2抗血清效价的确定

3.4.3抑制率IC50以及交叉反应率

3.5讨论

3.6本章主要结论

第四章抗体金标探针的制备以及检测方法的建立

4.1引言

4.2实验材料与方法

4.2.1实验材料

4.2.2实验方法

4.3结果与分析

4.3.1胶体金的合成原理

4.3.2胶体金的合成

4.3.3胶体金标记DON抗体最适条件的确定

4.3.4金标多克隆抗体的制备与纯化

4.3.5金标抗体复合物紫外分析

4.3.6金标探针红外光谱分析

4.3.7胶体金与抗体相互作用的荧光光谱

4.3.8检测体系构建原理

4.3.9硝酸纤维素膜(NC膜)的确定

4.3.10 DON-BSA包被稀释度的确定

4.3.11羊抗兔二抗点样浓度的确定

4.3.12胶体金粒径对检测体系的影响

4.3.13样品缓冲液体系

4.3.14显色时间测定

4.3.15检测重现性

4.3.16稳定性试验

4.4讨论

4.5本章主要结论

第五章胶体金免疫检测方法的应用及其与ELISA和HPLC的比较

5.1引言

5.2实验原料与方法

5.2.1原料

5.2.2主要仪器

5.2.3方法

5.3结果与分析

5.3.1高效液相色谱法

5.3.2酶联免疫检测方法

5.3.3胶体金免疫检测方法

5.4胶体金免疫检测和ELISA检测的相关性

5.5讨论

5.6本章小结

主要结论

问题与展望

致谢

参考文献

附录攻读硕士期间发表的文章