应用于高通量测序平台的两端测序文库方法探究

摘要

DNA测序技术已经成为现代生物学研究中极为重要的研究手段之一。自2005年起，基于高通量测序技术的新一代商用测序仪比原有产品更加快捷与廉价，取代了Sanger测序法代表的第一代测序技术成为了获取生物体遗传信息的常规方法。不管是开发新的高通量测序方法，或者对现有的商业平台进行优化，更高的测序速度与更低的测序成本是高通量测序方法的进一步发展的方向。
　　 尽管如此，高通量测序平台存在共通的发展瓶颈。模板制备以及随后的文库制备过程需要投入大量的人力物力与时间成本;不仅如此，较大的样品损失以及较低的通量也是急需克服的问题。本文从优化现有方法和开发新方法两个角度如手，旨在解决样品准备和文库制备过程中的难题。主要研究的内容如下:
　　 1.对模板制备损失十分大的超声破碎过程进行优化。研究的内容包括应用最广的商用超声打碎仪CovarisTM的各个参数意义的物理分析与实际检验，超声容器材质，样品的浓度，样品体积，占空比等条件对超声结果的影响，旨在获得用量最少，损失最小的DNA打碎条件，并使得打碎的DNA片段最为稳定集中。所得的优化条件组合，稳定，集中，并可在新一代超声平台推广。实验结果具有三个方面意义:降低实验耗材成本;实现痕量样品的测序;减少后续实验的步骤。并且对各参数的详细研究对于其他应用具有较高的参考价值。
　　 2.两端测序文库方法的开发。本研究基于乳液PCR和桥式PCR的原理，设计出既保留乳液PCR磁珠高效扩增与高通量的特征，又具有桥式PCR简便性的文库制备方法。该方法引入了两个高效的工具酶，稳定的实现了乳液包含的磁珠表面的单步桥式PCR，并可通过不同的接头从片段的两端进行测序。这样，该方法不仅集合了现有商业平台文库制备方法的优点，又可以通过两端测序将现有测序仪器的读长增加一倍。具体的工作包括工具酶的选择与酶促动力学的探究;两端测序方法的建立;优化传统乳液PCR过程以适用于新的实验设计。实验结果是确立了固液界面上核酸内切酶V与碱性磷酸酶的反应效率，并且制得了两端测序文库，并验证了其在高通量测序平台上应用的可行性。该方法成功增进了度长，降低了人力成本，简便了过程，具有不错的应用前景。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 新一代测序技术的发展现状

1．1．1 测序技术的发展与应用

1．1．2 新一代测序技术的特点

1．1．3 新一代测序技术商业化平台

1．1．4 新一代测序平台发展的局限性

1．2 新一代测序文库制备的发展状况

1．2．1 文库制备的发展

1．2．2 DNA片段化研究的进展

1．2．3 DNA扩增方法研究的进展

1．2．4 现有文库制备方法的优点与不足

1．3 本文研究的方向

1．3．1 本文研究的目的

1．3．2 本文研究的内容

第二章 用于高通量测序文库制备的DNA超声方法的优化

2．1 引言

2．2 实验目的与理论分析

2．2．1 实验目的

2．2．2 理论分析

2．2．3 仪器与样品

2．3 实验步骤与结果讨论

2．3．1 样品与容器类参数的探究

2．3．2 在超声打碎的过程维持温度参数的稳定

2．3．3 仪器与时间参数的综合探究

2．3．4 适合的理想条件的选择

2．4 本章小结

第三章 基于高通量测序平台两端测序文库的制备

3．1 引言

3．2 本文的设计思路

3．3 两端测序文库的技术难点

3．4 双引物的固定磁珠的制备

3．4．1 引言

3．4．2 设备材料与试剂

3．4．3 双引物固定磁珠的步骤

3．4．4 实验结果与讨论

3．5 核酸内切酶V作用于P1切割位点的效率

3．5．1 引言

3．5．2 实验试剂与器材

3．5．3 实验方法

3．5．4 图像扫描与数据处理

3．5．5 实验结果与讨论

3．5．6 结论

3．6 碱性磷酸酶用于P2探针解封闭的效率

3．6．1 引言

3．6．2 实验试剂与器材

3．6．3 实验过程

3．6．4 图像扫描与数据处理

3．6．5 实验结果与分析

3．6．6 结论

3．7 两端测序文库的制备

3．7．1 引言

3．7．2 两端测序文库样品准备

3．7．3 第一轮乳液PCR及磁珠富集

3．7．3 第二轮单步桥式PCR

3．7．4 实验设计层面的改进

3．8 讨论

第四章 总结与展望

4．1 课题研究总结

4．1．1 基于Covaris超声平台的样品打碎优化

4．1．2 基于高通量平台的两端测序文库的建立

4．2 展望

致谢

参考文献

附录