Foxp3CD4CD25调节性T细胞在大鼠肝移植自发免疫耐受中的作用

摘要

第一部分：大鼠肝移植模型的建立和移植肝内CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞的变化 目的：建立稳定的大鼠肝移植模型，并检测大鼠移植肝内CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞比例的变化。 方法：采用近交系成年雄性DA、LEW大鼠为供受体，改良“二袖套”法建立肝脏移植模型42例。术前随机分为3组：排斥组(DA→LEW，n=12)，耐受组(LEW→DA，n=15)，同基因组(DA→DA，n=15)。术后4、7、10 d随机各处死2例，收集肝脏标本和血标本，后两组术后30 d各处死3例，收集肝脏标本和血标本。分离肝组织内淋巴细胞，由流式检测CD4<'+>CD25<'+>T细胞比例。每组留6例来观察生存期，存活>60d时采血样，并处死3只，血标本检测AST、BILI浓度，肝脏标本观察移植物病理学变化。 结果：术后4d，三组均表现为高AST和低BILI，各组之间无统计学差异。术后7、10 d排斥组血清AST、BILI浓度均明显高于其余两组(P<0.05)。术后60d，耐受组和同基因组血清AST、BILI浓度正常，两组间无统计学差异(P>0.05)。术后7 d，排斥组肝脏病理表现为汇管区大量淋巴细胞浸润，并累及胆管、血管，肝小叶结构消失，伴有局灶性的出血、坏死，Banff评分Ⅲ级。耐受组汇管区表现为中等量的淋巴细胞浸润，未侵及肝实质、胆管和血管，Banff评分Ⅰ-Ⅱ级，同基因组汇管区为少至中等量淋巴细胞浸润，胆管、血管未受侵犯，Banff评分O-Ⅰ级。各组的中位生存期：排斥组为12d，耐受组106d，同基因组128 d。排斥组生存时间明显短于其他两组(p<0.01)，耐受组和同基因组之间无统计学差异(p>0.05)。肝移植早期，急性排斥组和自发耐受组的移植肝内CD4<'+>CD25<'+>Tr细胞比例均增加，约在4 d时达到高峰，急性排斥组的急性排斥反应最为明显。移植后30 d，自发耐受组受者的移植肝内CD4<'+>CD25<'+>T细胞比例达到第二次高峰，在移植后60 d时仍维持在较的高水平。 结论：DA与LEW大鼠组合可建立稳定可靠的肝脏急性排斥模型与自发耐受模型，两种模型的肝功能变化、移植物病理表现、生存期分别符合急性排斥和自发耐受的特点。自发耐受模型肝内CD4<'+>CD25<'+>T细胞亚群比例变化趋势，与其他学者报道的调节细胞变化趋势一致，说明调节细胞可能参与自发免疫耐受的形成。 第二部分：MACS双阳性法分选大鼠外周血内的CD4<'+>CD25<'+>T细胞 目的：利用细胞磁分离系统(MACS)高效快速的分离大鼠外周血CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞。 方法：采用免疫磁珠两步法分离大鼠外周血内的CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞，首先采用．Anti-rat CD4-APC和Anti-APC MultiSortMicroBeads阳性分选出CD4<'+>细胞，再用Anti-rat CD25-PE和．Anti-PEMicroBead阳性分选获得CD4<'+>CD25<'+>T细胞。分离后的细胞经流式细胞仪检测分离纯度和细胞活性；体外增殖实验检测其对CD4<'+>CD25T细胞的免疫抑制作用。RT-PCR检测CD4<'+>CD25<'+>T细胞中Foxp3基因的表达。 结果：双阳性分选后获得的CD4<'+>CD25<'+>T细胞纯度为94.2％±1.1％(87％～98％)，细胞存活率93.8％±3.4％(93％～95％)，体外增殖实验表明CD4<'+>CD25<'+>T细胞能明显抑制CD4<'+>CD25T细胞的增殖(CD25<'+>/CD25<'->vs CD25，P<0.01)。分离得到的CD4<'+>CD25<'+>T细胞中有明确的Foxp3基因的表达。 结论：采用MACS系统双阳性分选可以高效、快速的获得理想纯度和免疫抑制功能的大鼠CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞。 第三部分：自发免疫耐受大鼠移植肝内转录因子Foxp3的表达 目的：探讨大鼠同种异体肝移植肝内转录因子Foxp3的变化与自发免疫耐受的关系。 方法：利用第一部分耐受组和同基因组肝移植后4d、7d、10d、30d、60d冻存的肝组织，通过实时荧光定量PCR、检测大鼠移植肝内Foxp3mRNA的表达；Western-Blot检测肝内Scurfin含量的变化。 结果：大鼠肝移植早期Foxp3 mRNA及其蛋白产物Scurfin的明显下降，在7 d左右开始上升，10 d达到峰值，30 d后Foxp3 mRNA表达水平开始下降，但仍高于正常值。 结论：转录因子Foxp3可能参与大鼠肝脏移植自发免疫耐受的形成。

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论文说明：缩略词

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摘要

第一部分：大鼠肝移植模型的建立和肝内CD4+CD25+调节性T细胞的变化

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

小结

参考文献

第二部分：MACS双阳性法分选大鼠外周血内的CD4+CD25+T细胞

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第三部分：自发免疫耐受大鼠移植肝内转录因子Foxp3的表达

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

小结

参考文献

硕士研究生期间科研工作总结

致谢

文献综述