NF--κB信号通路在人根尖牙乳头干细胞增殖及定向分化中的作用机制研究

摘要

核转录因子kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）普遍存在于细胞胞浆中，参与多种生理、病理过程。研究表明NF-κB信号通路通过自身或与其他信号通路共同作用，在牙齿的形成和萌出过程中发挥重要功能，该信号通路的阻断可引起牙发育障碍。目前，NF-κB信号通路对人根尖牙乳头干细胞(stem cellsfrom the apical papilla，hSCAPs)的增殖及牙/骨向分化能力的影响鲜有文献报道。 第一部分 hSCAPs的分离培养及鉴定 研究目的:获得纯化的人牙乳头干细胞。 研究方法:收集根尖未发育完成的健康第三磨牙，剥离根尖牙乳头组织，酶消化法分离培养根尖牙乳头干细胞，免疫磁珠法分选纯化所培养细胞。免疫细胞化学染色和流式细胞仪检测细胞表面标记物表达，验证其间充质干细胞特性。 实验结果:纯化后的人根尖牙乳头细胞呈纺锤形或成纤维细胞样，贴壁生长;STRO-1阳性表达，角蛋白(CK)阴性表达，流式细胞仪结果显示其间充质干细胞表面标记（CD29、CD73、CD90、CD105和CD146）呈阳性表达，造血干细胞表面标记物（CD34和CD45）呈阴性表达。 结论:通过酶消化法和免疫磁珠分选可纯化人牙乳头干细胞，体外培养时该细胞增殖活性较强，经细胞表面标记检测证实该细胞为间充质来源。 第二部分 hSCAPs中NF-κB信号通路的激活和抑制试验 研究目的:检测NF-κB信号通路激活剂和抑制剂作用于人根尖牙乳头干细胞后，通路相关蛋白的表达。 研究方法:取生长状态良好的第3代人牙乳头干细胞无血清培养24h后，分别用NF-κB信号通路经典激活剂TNF-α(10 ng/mL)或特异性抑制剂BMS-345541（1μmol/L）刺激细胞，提取胞浆蛋白，western blot法检测NF-κB信号通路相关蛋白IκBα、P-Iκ Bα、P65、P-P65的表达情况 实验结果:Western blot结果显示，经TNF-α作用后，hSCAPs胞浆中P-IκBα、P-P65表达水平随时间延长而升高;BMS-345541刺激组中细胞胞浆内NF-κB信号通路蛋白磷酸化水平逐渐降低。蛋白定量分析显示在15 min、30 min和60 min时TNF-α组P-IκBα与IκBα、P-P65与P65之间比值较0 min高，而BMS-345541刺激组中P-Iκ Bα与IBα、P-P65与P65之间比值明显低于0 min，差异具有统计学意义（P＜0.05）。 结论:10 ng/mL TNF-α和1μmol/L BMS-345541可有效激活和抑制NF-κB信号通路。 第三部分 NF-κB信号通路对hSCAPs增殖与分化能力的影响 研究目的:探讨NF-κB信号通路激活或抑制状态下，对人牙乳头干细胞增殖及分化能力的影响。 研究方法:分别用NF-κB信号通路激活剂和抑制剂作用于hSCAPs，MTT和流式细胞术(FCM)检测NF-κB信号通路激活或抑制后细胞增殖能力的改变，细胞划痕实验用于检测细胞迁移能力;ALP试剂盒检测碱性磷酸酶(ALP)活性、茜素红染色与CPC溶解钙结节实验用来检测钙盐沉积情况，提取细胞总RNA和总蛋白，实时定量逆转录聚合酶链式反应实验(real-time RT-PCR)检测牙向/骨向分化相关基因(ALP、OCN、BSP、OSX、RUNX2、DSPP、OP和DMP-1)的表达情况，蛋白免疫印迹实验（western blot）检测牙向/骨向分化相关蛋白(OCN、BSP、OSX、RUNX2、DSP、OPN和DMP-1)的表达情况。 研究结果:当NF-κB信号通路被激活后，hSCAPs增殖活性提高，通路激活组hSCAPs增殖指数明显高于对照组，体外矿化实验结果表明NF-κB通路激活组hSCAPs的ALP活性增高，形成的钙结节大而密，CPC结果显示结节中钙离子浓度升高，牙骨向分化相关基因及蛋白表达量上调，差异有统计学差异(P＜0.05)。阻断NF-κB信号通路后，hSCAPs的细胞增殖指数下降，细胞开始迁移的时间延迟，距离缩短，与对照组相比NF-κB抑制组hSCAPs的ALP活性、成牙/成骨向分化相关(ALP、OCN/OCN、BSP/BSP、OSX/ OSX、RUNX2/RUNX2、DSPP/ DSP、OPN/和 DMP-1/ DMP-1)基因及蛋白的表达均显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 结论:NF-κB信号通路在hSCAPs的增殖和分化过程中发挥重要作用。

目录

声明

英文缩略语表

摘要

前言

第一部分 人牙乳头干细胞的分离培养及鉴定

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二部分 hSCAPs中NF-κB信号通路的激活和抑制实验

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第三部分 NF-κB信号通路对hSCAPs增殖与分化能力的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

全文总结

参考文献

文献综述 NF-κB信号通路在牙组织工程学中的研究进展

攻读学位期间发表文章情况

致谢