秀丽线虫酪胺信号调控白色念珠菌规避行为分子机制研究

摘要

微生物深刻影响宿主生物体的免疫、代谢以及行为等多种生理生物学进程。秀丽线虫对作为营养源的不同微生物会表现出不同的行为响应，在遭遇致病性微生物时主要激活两种防御机制，即保守的固有免疫应答和对病原体的规避行为反应。秀丽线虫对病原体的识别、区分能力以及对致病菌的规避反应对其生存至关重要。然而目前关于秀丽线虫规避行为研究主要集中在革兰氏阳性或者革兰氏阴性细菌方面，对于致病性真菌的规避行为研究模型还没有被建立起来。神经递质酪胺在动物的多种行为调控中发挥关键作用，而关于酪胺信号调控秀丽线虫对致病真菌规避行为的研究尚未见报导。为此，本研究将侧重于解析酪氨酸脱羧酶TDC-1及其受体SER-2参与秀丽线虫对致病性真菌规避行为调控的神经分子机制。 tdc-1基因缺失突变会引起秀丽线虫对白色念珠菌的规避行为缺陷，外源性酪胺（Tyramine，TA）能够显著增强秀丽线虫的规避行为。白色念珠菌SC5314感染TDC-1∷GFP转基因秀丽线虫4小时至24小时，TDC-1∷GFP表达量均呈现明显上调。组织特异性恢复实验结果发现，TDC-1可以在秀丽线虫的RIM中间神经元发挥对白色念珠菌SC5314的规避行为调控功能。在秀丽线虫对白色念珠菌SC5314规避行为响应进程中，RIM神经元中的GLR-1（一种AMPA离子型谷氨酸受体）能够通过其下游转录因子LIM-4作为TDC-1上游信号分子参与秀丽线虫对白色念珠菌的规避行为调控，即形成了GLR-1-LIM-4-TDC-1规避行为调控信号级联。TDC-1又能够在RIM神经元中通过其下游靶点NKAT-1和神经肽FLP-18参与这一进程。神经肽FLP-18释放后可以激活SAA中间神经元中的NPR-1G蛋白偶联受体参与秀丽线虫规避行为响应。因此，在酪胺信号调控白色念珠菌规避行为过程中，形成了TDC-1-NKAT-1-FLP-18-NPR-1调控信号级联。 酪胺信号分子还可以通过其对应受体蛋白发挥功能。在共3个受体分子中，ser-2基因缺失突变同样能够引起秀丽线虫对白色念珠菌SKA条件下敏感性，导致秀丽线虫的规避行为缺陷。白色念珠菌SC5314感染SER-2∷GFP转基因秀丽线虫12小时，ser-2在AIY中间神经元中的表达量明显上调。组织特异性恢复实验以及神经元特异性杀死实验证明SER-2在AIY中间神经元参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为调控。酪胺受体SER-2的下游转录因子蛋白FAX-1被鉴定出参与这一进程。转录因子FAX-1进一步激活下游靶点NCS-1（一种神经元钙感知蛋白）参与调控白色念珠菌规避行为。 总之，本研究提供的证据证明了酪胺信号在动物规避真菌感染行为中的重要调控功能。一方面，本研究揭示出酪氨酸脱羧酶TDC-1及其受体SER-2在秀丽线虫规避行为调控中发挥着关键作用。同时，我们还鉴定出GLR-1-LIM-4-TDC-1-NKAT-1-FLP-18-NPR-1信号级联，即酪胺可以通过神经肽FLP-18在神经元RIM-SAA神经环路中参与秀丽线虫对真菌感染的规避行为防御分子调控功能。透彻解析秀丽线虫酪胺信号分子所介导的对真菌规避行为调控分子机制和神经环路，有助于加深我们对神经递质酪胺的关键作用以及秀丽线虫作为宿主与周围环境致病菌之间相互作用关系的理解。

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摘要

Abstract

主要缩略词表

前言

第一章 文献综述 秀丽线虫应对致病性微生物的 规避行为研究进展

1．神经元中参与秀丽线虫规避行为调控的分子信号

1.1 HECW-1-NPR-1参与秀丽线虫规避行为调控

1.2 TAX-2/TAX-4 cGMP门控通道蛋白参与秀丽线虫规避行为调控

1.3 DAF-10参与秀丽线虫规避行为调控

1.4 硒蛋白T（SELT-1.1）参与秀丽线虫规避行为调控

1.5 Toll/TOL-1信号参与秀丽线虫规避行为调控

1.6 TIR-1-NSY-1-SEK-1-PMK-1信号参与秀丽线虫规避行为调控

1.7 DAF-7/TGF-β信号参与秀丽线虫规避行为调控

1.8 ILR/DAF-2信号参与秀丽线虫规避行为调控

1.9 Gαq蛋白EGL-30参与秀丽线虫规避行为调控

1.10 SOD-1参与秀丽线虫规避行为调控

2．感觉神经元参与秀丽线虫规避行为调控

3．肠道中参与秀丽线虫规避行为调控的分子信号

3.1 INS-11参与秀丽线虫规避行为调控

3.2 GPCR FSHR-1参与秀丽线虫规避行为调控

4．秀丽线虫应对致病性微生物的学习行为

4.1 5-羟色胺信号参与秀丽线虫的学习行为调控

4.2 神经肽信号INS-6/INS-7参与秀丽线虫的学习行为调控

4.3 保守蛋白EOL-1参与秀丽线虫的学习行为调控

4.4 TGF-β/DBL-1信号参与秀丽线虫的学习行为调控

5. small RNA信号参与秀丽线虫的规避行为调控

5.1 mir-67-SAX-7参与秀丽线虫的规避行为调控

5.2 苏云金芽孢杆菌中small RNA介导秀丽线虫的规避行为调控

1.6 问题与展望

参考文献

第二章 秀丽线虫酪氨酸脱羧酶TDC-1对白色念珠菌规避行为调控的分子机制研究

前言

2.1材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.1.1秀丽线虫品系

2.1.1.2实验菌株

2.1.1.3实验试剂

2.1.2实验方法

2.1.2.1 秀丽线虫的培养

2.1.2.2 秀丽线虫的同步化

2.1.2.3 秀丽线虫的冻存与复苏

2.1.2.4 质粒构建

2.1.2.5 RNAi菌株的质粒构建

2.1.2.6秀丽线虫喂饲法RNAi[29, 30]

2.1.2.7 基因枪遗传操作

2.1.2.8 显微注射遗传转化

2.1.2.9 秀丽线虫的RNA提取与逆转录

2.1.2.10实时定量PCR（qRT-PCR）分析相关基因表达量变化

2.1.2.11 秀丽线虫的规避行为研究模型

2.1.2.12秀丽线虫的咽泵速率检测

2.1.2.13统计分析

2.2结果与分析

2.2.1 酪氨酸脱羧酶TDC-1参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为调控

2.2.2 外源性酪胺可以增强秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为

2.2.3 外源性酪胺抑制秀丽线虫的咽泵速率，并导致其体内的白色念珠菌积累量显著增加

2.2.4 tdc-1基因缺失突变会导致秀丽线虫体内白色念珠菌的积累量显著增加

2.2.5 TDC-1在RIM中间神经元中特异性调控秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为

2.2.6 特异性沉默RIM中间神经元活性能够导致秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为缺陷

2.2.7 验证TDC-1参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为调控功能

2.2.8 tdc-1基因缺失突变能够改变RIM中间神经元中一些基因的表达模式

2.2.9 nkat-1和flp-18参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为调控

2.2.10 nkat-1和flp-18可以在RIM神经元参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为调控

2.2.11 鉴定TDC-1和NKAT-1在参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为调控中的遗传关系

2.2.12 鉴定TDC-1和FLP-18在参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为调控中的遗传关系

2.2.13 鉴定NKAT-1和FLP-18在参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为调控中的遗传关系

2.2.14 NPR-1介导神经肽FLP-18下游参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为调控

2.2.15 鉴定NPR-1参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314规避行为调控的功能神经元

2.2.16 鉴定TDC-1参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314规避行为调控的上游信号分子

2.2.17 鉴定GLR-1、MOD-1、CAM-1 和TDC-1在参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314规避行为调控中的关系

2.2.18 GLR-1在RIM神经元参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314规避行为调控

2.2.19 鉴定GLR-1参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314规避行为调控作用中的下游转录因子

2.2.20 GLR-1通过下游转录因子LIM-4参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314规避行为调控

2.2.21 LIM-4介导TDC-1上游参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为调控

2.3讨论

参考文献

第三章 酪胺受体SER-2调控秀丽线虫对白色念珠菌规避行为的分子机制研究

前言

3.1材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.1.1秀丽线虫野生型、突变体和转基因品系

3.1.1.2实验菌株

2.1.1.3实验试剂

3.1.2实验方法

2.1.2.1 秀丽线虫的培养

2.1.2.2 秀丽线虫的同步化

2.1.2.3 秀丽线虫的冻存与复苏

2.1.2.4 质粒构建

2.1.2.5 RNAi菌株的质粒构建

2.1.2.6秀丽线虫喂饲法RNAi

2.1.2.7 基因枪遗传操作

2.1.2.8 显微注射遗传转化

2.1.2.9 秀丽线虫的RNA提取与逆转录

2.1.2.10实时定量PCR（qRT-PCR）分析相关基因表达量变化

2.1.2.11 秀丽线虫的规避行为研究模型

2.1.2.12秀丽线虫的咽泵速率检测

2.1.2.13统计分析

3.2结果与分析

3.2.1 酪胺受体SER-2参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为调控

3.2.2 ser-2缺失突变引起秀丽线虫体内白色念珠菌积累量明显增加

3.2.3 AIY中间神经元可能参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为调控

3.2.4 SER-2在AIY中间神经元中特异性调控秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为

3.2.5 特异性沉默AIY中间神经元活性导致秀丽线虫对白色念珠菌SC5314规避行为缺陷

3.2.6 鉴定ser-2参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314规避行为调控的靶基因

3.2.7 FAX-1可以在AIY中间神经元中参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为调控

3.2.8 AIY中间神经元中过表达fax-1能够增强秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为响应

3.2.9 秀丽线虫中酪胺受体SER-2对于FAX-1的表达是必需的

3.2.10 鉴定FAX-1在秀丽线虫对白色念珠菌SC5314规避行为调控中的下游靶点蛋白

3.2.11 NCS-1介导FAX-1在AIY中间神经元参与秀丽线虫对白色念珠菌SC5314的规避行为调控

3.3讨论

3.4总结

参考文献

致谢

附录 1 攻读博士学位期间发表的论文目录