特异性艾滋病核酸疫苗转导载体的构建及初步应用

摘要

当下，在全世界对控制和预防艾滋病病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）感染工作中尚无完全有效手段的前提下，要有效的预防并控制艾滋病病毒的感染，最佳的思路是开发出一种能够安全、有效的预防艾滋病病毒感染的疫苗。
　　本研究的目的是构建一种新型的具有特异性的基因转导载体TG蛋白。基于穿膜肽信号肽（TAT）、DNA识别及结合序列系统（GAL4/UAS）上，添加适当的纯化及鉴定标签His-tag，定向克隆得到编码TG蛋白的基因片段。以原核表达系统中的pET-28a为载体构建了并得到了原核表达重组质粒pET-TG。GAL4蛋白具有能够与UAS核苷酸序列特异性结合的能力，所以经过纯化的TG蛋白在一定条件下可在机体外与嵌入荧光蛋白基因EGFP片段的pVAX1-UAS-EGFP质粒特异性结合，然后再利用琼脂糖凝胶电泳实验就可以直观的证明TG蛋白可与
　　pVAX1-UAS-EGFP质粒特异性结合。再摸索出TG蛋白与pVAX1-UAS-EGFP质粒结合活性最高时的质粒蛋白浓度和时间条件。在细胞水平上将蛋白与质粒特异性的结合物产物与293T细胞共浴，最后在荧光显微镜下通过对荧光的检测研究TG蛋白的细胞转导活性。
　　通过大肠杆菌表达系统表达分子量为21kDa的目的蛋白。通过琼脂糖凝胶电泳可以看出质粒与蛋白结合活性最强时质粒量为10g，蛋白量为16g，同时TG蛋白在10min内即可与pVAX1-UAS-EGFP结合，2h内其结合效率无明显变化。通过细胞转导发现pVAX1-UAS-EGFP质粒与TG蛋白结合的结合物转导293T细胞均出现特异性荧光，表明TAT基因具有穿膜作用的。本研究为艾滋病核酸疫苗转导载体研究的进一步深入提供依据。

目录

声明

前言

1 艾滋病毒的分子生物学特性、分布及防制技术研的究进展

2 艾滋病及艾滋病毒的防治

3 疫苗

4 DNA疫苗转导载体

5 穿膜肽

6 DNA序列识别及结合系统

7 本研究的意义

实验材料

1 菌株、质粒和细胞

2 酶与试剂

3 主要仪器

4 各种溶液及培养基

方法

1 DNA疫苗的构建

2 重组原核表达质粒pET-TG的构建、表达及纯化

3 目的蛋白与重组质粒的结合活性研究

4 目的蛋白的细胞转导活性实验

结果

1 DNA疫苗重组质粒载体的酶切鉴定

2 目的基因的克隆及重组质粒的鉴定

3 TG蛋白的原核表达、鉴定及纯化

4 蛋白与质粒结合活性实验结果

5 细胞转导活性实验结果

讨论

结论

参考文献

致谢

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