蒲公英萜醇对乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用及机制研究

摘要

目的:体外研究蒲公英萜醇（Taraxerol）对乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用，并探讨可能的分子机制。
　　方法:采用噻唑蓝实验检测蒲公英萜醇对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231增殖能力的影响，筛选出对药物敏感的细胞以及合适的浓度和时间进行后续实验;应用平板克隆实验检测蒲公英萜醇对细胞的集落形成能力影响;采用DCFH-DA荧光染色法观察细胞内活性氧生成量变化;利用Hoechst荧光染色检测在蒲公英萜醇的作用下，乳腺癌细胞凋亡的形态学变化;通过流式细胞术检测细胞凋亡率;应用吖啶橙染色、透射电镜、免疫荧光染色观察蒲公英萜醇处理后细胞发生自噬的情况;利用Western blot实验检测蒲公英萜醇用药后细胞凋亡和自噬相关蛋白表达以及相关信号通路的变化情况。
　　结果:MTT结果显示蒲公英萜醇对MDA-MB-231细胞没有明显影响，MCF-7细胞的增殖能力受到显著抑制且呈浓度依赖性;显微镜下观察用药后MCF-7细胞数量减少;平板克隆实验结果显示蒲公英萜醇可显著抑制MCF-7细胞克隆形成能力;DCFH-DA染色结果显示，用药组细胞内ROS水平升高;Hoechst实验结果表明，蒲公英萜醇用药组细胞出现凋亡小体等细胞凋亡形态学特征;流式细胞术检测发现用药后MCF-7细胞凋亡率明显上升;Western blot实验结果显示，蒲公英萜醇用药后Bcl-2蛋白表达水平下降(P＜0.05)，Bax/Bcl-2的比值升高(P＜0.01)，PARP和Survivin蛋白的表达下调(P＜0.01)(P＜0.01)，Cleaved caspase-3，Cleaved caspase-9的表达上调(P＜0.01)(P＜0.01)。吖啶橙染色结果显示，用药组细胞胞浆内橙红色嗜酸性小泡的数量明显增多;透射电镜观察到用药组细胞内出现明显的自噬体结构;免疫荧光实验和Western blot结果显示，蒲公英萜醇可以上调Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值也逐渐升高(P＜0.01)(P＜0.01);给予自噬抑制剂3-MA后，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化明显降低(P＜0.05)。且蒲公英萜醇用药后，细胞内mTOR和4EBP1蛋白的磷酸化水平显著下调(P＜0.01)(P＜0.05)，mTOR信号通路受到抑制。
　　结论:蒲公英萜醇在体外可明显抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖，其作用可能与诱导细胞发生凋亡和自噬，抑制mTOR信号通路有关。

目录

声明

摘要

中英文缩略词

1．1 药品

1．3 主要试剂和耗材

1．4 抗体

1．5 实验仪器

第二章 方法

2．1 细胞培养

2．2 细胞增殖检测

2．3 ROS染色

2．4 细胞凋亡检测

2．5 细胞自噬检测

2．6 统计学处理

第三章 结果

3．1 蒲公英萜醇对乳腺癌细胞的增殖抑制作用

3．2 蒲公英萜醇提高乳腺癌MCF-7细胞内ROS水平

3．3 蒲公英萜醇诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡

3．4 蒲公英萜醇诱导乳腺癌MCF-7细胞发生自噬

3．5 相关信号通路的检测

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢