冰糖橙皮上曲酸高产菌的选育及发酵工艺研究

摘要

曲酸(Kojic acid),化学名5-羟基-2-羟甲基-1,4-吡喃酮,是由真菌好氧发酵产生的一种弱酸性次级化合物,其具有酪氨酸酶抑制能力、抑菌能力、对氧化酶的抑制作用以及对金属离子的螯合作用等,可作为美白祛斑剂、食品防腐剂和保鲜剂、止痛剂、杀虫剂、香料等应用于食品、化妆品、医药、农业等相关领域均有很大的应用价值。另外,曲酸还可以作为香料合成和可降解塑料合成的中间体等。由于目前国内外曲酸发酵生产技术尚不够成熟,市场上的曲酸供不应求,价格昂贵,因此必须大力开展曲酸发酵生产的研究。
　　 本文以冰糖橙皮作为材料,从霉变的冰糖橙皮上筛选优良的曲酸生产菌,通过不同的物理方法对其进行逐级诱变,同时对曲酸的发酵生产工艺进行了研究,最后对曲酸的提取方法进行了系统研究,研究主要结果如下:
　　 1.从霉变的冰糖橙皮中筛选获得一株具有优良性状的曲酸生产菌,曲酸产量达到15.68g/L,通过比较菌株的菌落特征和显微特征,鉴定此菌株为米曲霉,本研究将其编号为米曲霉A-55。
　　 2.以米曲霉A-55作为出发菌株,对其进行UV、微波和60Co三轮诱变:一,20W紫外灯距离30 cm照射20 min条件下获得米曲霉突变株UV-78,曲酸得率为37.8 g/L,较出发菌株提高141.1％；二,以米曲霉变异株UV-78为出发菌株,用功率为800W,脉冲频率为2450 Hz的微波炉对其进行微波诱变,微波累计处理时间为6 min时筛选获得米曲霉变异株M-33,曲酸得率为59.7g/L,较出发菌株曲酸得率提高57.9％;三,以米曲霉变异株M-33为出发菌株,对其进行60Co-γ辐射诱变,最佳辐射诱变剂量为800 Gy,在此条件下筛选获得一优良米曲霉变异株Co-26,曲酸得率为70.1g/L,较出发菌株得率提高17.4％。
　　 3.向米曲霉变异株Co-26的初始发酵培养基中加入一定浓度梯度的乙醇作为曲酸生成促进剂,结果表明添加质量浓度为6％无水乙醇的效果最好,曲酸得率在原来基础上提高16％。在此基础上,通过单因素试验,确定最优碳源和氮源分别为可溶性淀粉和蛋白胨；通过Plackett-Burman实验设计,筛选出3个对曲酸产量有显著影响的因素为:可溶性淀粉、蛋白胨和初始pH。通过最都爬坡试验确定此3个显著因子的最佳响应面试验取值水平,之后通过Box-Behnken试验设计及回归分析,最终得到的最佳培养基为:可溶性淀粉8.3g/L,蛋白胨5.0g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,KH2PO41.0g/L,KCl0.5g/L,FeSO40.01 g/L,初始pH6.1,曲酸产量达到最大值99.89 g/L。
　　 4.对影响脱色效果的四个因素进行单因素试验,最终确定活性炭最佳用量为3％、脱色pH为3.5、脱色温度为80℃、脱色时间为40 min时,得到77.68％的脱色率,98.78％的曲酸收率。另外,通过使用阳离子交换树脂更好的去除粗制曲酸溶液中的杂质阳离子后,采取直接浓缩结晶的方法直接制得曲酸结晶,最终获得的曲酸结晶的收率为78.67％,产品纯度为98.26％。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

1 绪言

1.1 曲酸的结构及其性质

1.1.1 曲酸的分子结构

1.1.2 曲酸的理化性质

1.1.3 曲酸的生理活性

1.1.4 曲酸的毒理学

1.2 曲酸的应用

1.2.1 曲酸在食品方面的应用

1.2.2 曲酸在化妆品中的应用

1.2.3 曲酸在医药方面的应用

1.2.4 曲酸在农业中的应用

1.2.5 曲酸在其他方面的应用

1.3 曲酸的发酵法生产

1.3.1 曲酸生产菌种

1.3.2 曲酸发酵生产工艺条件

1.3.3 曲酸的提取

1.4 曲酸研究现状

1.5 曲酸研究目的意义及主要内容

1.5.1 本课题研究的意义

1.5.2 研究内容

2 曲酸生产菌的筛选及其鉴定

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料与试剂

2.2.2 主要实验仪器

2.2.3 培养基及染色液

2.2.4 曲酸含量的测定

2.2.5 菌株筛选

2.2.6 菌种鉴定

2.3 结果与分析

2.3.1 菌种筛选

2.3.2 菌种鉴定结果

2.4 小结

3 曲酸生产菌的诱变选育

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌种

3.2.2 主要试剂及诱变剂

3.2.3 主要实验仪器

3.2.4 培养基

3.2.5 诱变方法

3.2.6 诱变剂量和时间的确定

3.2.7 突变株筛选

3.2.8 遗传稳定性实验

3.2.9 突变株保藏

3.3 结果与分析

3.3.1 UV诱变

3.3.2 微波诱变

3.3.3 60Co诱变

3.4 小结

4 曲酸发酵工艺研究

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌种

4.2.2 试剂

4.2.3 主要实验仪器

4.2.4 培养基

4.2.5 分析方法

4.2.6 促进剂对曲酸生成的影响

4.2.7 单因素实验

4.2.8 Plackea-Burman试验设计

4.2.9 最陡爬坡试验设计

4.2.10响应面试验设计

4.3 结果与讨论

4.3.1 不同促进剂对曲酸产量的影响

4.3.2 单因素的确定

4.3.3 Plackett-Burman设计法筛选影响产曲酸的主效因子

4.3.4 最陡爬坡实验

4.3.5 响应面分析法优化培养基

4.4 小结

5 曲酸的提取

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 试剂

5.2.2 主要仪器

5.2.3 分析方法

5.2.4 曲酸粗制晶体的制各

5.2.5 活性炭脱色处理

5.2.6 离子交换树脂去除杂质

5.3 结果与分析

5.3.1 曲酸粗制晶体的制备

5.3.2 活性炭脱色参数的确定

5.3.3 离子交换树脂去除杂质的效果

5.3.4 曲酸精制晶体的获得

5.4 小结

6 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

6.3 创新点

参考文献

附录

致谢