NGX6对Wnt信号传导通路的影响及姜黄素促进NGX6抑制结肠癌细胞增殖的机制研究

摘要

结直肠癌的发生、发展是多基因、多阶段事件，其发病机制涉及多个抑瘤基因的失活和瘤基因的激活。我们的前期工作已经证实NGX6在结肠癌，尤其是有远处转移的结肠癌组织中表达明显下调甚至缺失，转染NGX6的结肠癌细胞系HT-29的细胞周期可被阻滞在G1一S期，从而抑制结肠癌细胞的过度增殖。同时，NGX6基因通过下调EGF介导的酪氨酸激酶信号传导通路中的一些与增殖相关的重要分子的表达而发挥抑制结肠癌细胞增殖的效应，并初步揭示NGX6可能通过下调MMPl4的表达而参与大肠癌转移的抑制。进一步通过高通量基因芯片技术检测NGX6基因对结肠癌细胞系HT一29基因表达谱的影响，结果发现表达差异3倍以上的基因有377个。其中有4个与Wnt信号通路有关的基因，表达上调基因DKKl，表达下调基因ILK、MMPl以及COL11Al。这些分子的表达上／下调均能导致结肠癌中Wnt信号通路的抑制，并能够抑制结肠癌细胞的增殖和转移。这提示NGX6基因有可能通过参与调节Wnt信号通路上的相关分子发挥抑制结肠癌增殖和转移的作用。 本研究在前期工作的基础上，深入研究了NGX6对Wnt信号通路的影响。通过荧光素酶报告基因分析测定法检测NGX6对结肠癌HT一29细胞系中Wnt通路的关键分子Tcf4及下游靶基因cyclinDl的活性的影响。发现瞬时转染了NGX6的HT一29细胞系中Tcf4的活性下降。通过Western blot方法检测NGX6对Wnt通路下游靶基因c—myc、cyclinDl的表达的影响，显示NGX6转染组细胞的两种蛋白表达均有下降。运用RT-PCR方法检测：NGX6对Wnt通路下游基因COX-2的影响，结果显示转染了NGX6的HT-29细胞的COX-2mRNA水平下降。因此，推断NGX6基因通过Wnt信号通路抑制结肠癌细胞系HT-29的增殖与转移。 姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄的根茎中提取的一种酚类色素，主要药理作用包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等，且毒性很低。目前其作为一种安全的抗肿瘤药物引起多数学者的关注，本研究为明确姜黄素与NGX6在抑制结肠癌细胞增殖、诱导凋亡及改善细胞间连接通讯功能方面是否存在协同效应，拟在前部分研究基础上，通过生长曲线、MTT、划痕实验、AO／EB、流式细胞术方法来进行验证。MTT结果显示转染了NGX6组的细胞在570nm处的吸光度较空白载体组下降(p<0.05)；而姜黄素干预后的吸光值明显下降；划痕实验显示NGX6转染组细胞间隙连接通讯功能增加而姜黄素干预后此功能增加更明显，提示姜黄素与NGX6在以上方面存在协同作用，且呈剂量依赖效应；AO／EB与流式细胞术测定姜黄素能促进HT-29细胞的凋亡但与NGX6基因无协同作用。同时我们运用RT-PCR方法检测姜黄素对HT-29细胞的NGX6表达水平的影响，结果发现随着姜黄素浓度增加，NGX6mRNA表达水平增加。提示姜黄素作用于结肠癌HT-29细胞系的机制可能是与上调NGX6的表达水平来发挥作用有关，其具体的机制还有待进一步研究。

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β-catenin/Tcf4通路与结直肠癌关系的研究进展

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