湖南人群非综合征性耳聋GJB2(Cx26)基因突变分析及功能研究

摘要

目的：为明确湖南人群中非综合征性耳聋患者发病的遗传学基础，分析了患者GJB2基因突变的情况，并探索其发病的分子机制。
　　 方法：经过详细的病史询问和临床检查，收集了符合要求的、无亲缘关系的非综合征耳聋患者140例。PCR扩增患者GJB2基因的编码序列全长，纯化回收扩增产物，直接双向测序，用DNAStar软件分析测序结果，统计患者GJB2基因突变情况。选择研究中发现的突变，设计引物扩增突变体全长，将其构建到pEGFP表达载体，经菌液PCR检测、双酶切鉴定并测序验证之后，转染Hela细胞，行Western blot检测，荧光染色后在荧光显微镜下观察Cx26的表达情况，比较野生型与突变体之间亚细胞定位的差别；计数它们形成间隙连接通道的细胞数目，统计分析是否存在差异。
　　 结果：在140个无亲缘关系的耳聋患者中，共有56例检测到了Cx26基因突变，检出率达40％(56/140)；其中29例患者两个Cx26等位基因都发生突变，另27例患者只有一个Cx26等位基因突变，等位基因突变率为30.4％(85/280)。一共发现了10种不同的碱基变异，包括7种致病突变和3种多态。7种致病突变分别是无义突变c.139G＞T；移码突变c.176191de116和c.235delC；错义突变c.109G＞A、c.344T＞G、c.550C＞T和c.571T＞C。c.344T＞G是一个新报道的错义突变。最常见的突变是235delC，共有27个患者检测到该突变，比例达19.3％(27/140)，其中纯合突变20例，复合杂合突变2例，杂合突变5例，占所有致病性等位基因的55.3％（47/85等位基因）。109G＞A突变频率仅次于235delC，有25个患者检测到该突变，检出率达17.9％(25/140)，其中纯合突变7例，杂合突变18例，占所有致病性等位基因的37.6％（32/85等位基因）。选择在患者中发现的突变，构建了Cx26wt及其突变体的真核表达载体：pEGFP-Cx26wt，pEGFP-Cx26V37I和pEGFP-Cx26F115C；转染Hela细胞后，成功表达Cx26wt及其突变体的GFP融合蛋白；但是突变体在细胞定位和分布上与Cx26wt无区别，形成通道的细胞数目也没有明显的差异。
　　 结论：Cx26是导致湖南人群NSHL的最常见的基因，其235delC突变是湖南人群NSHL最常见的突变；Cx26基因p.F115C和p.V37I两种突变体转染Hela细胞后，不影响其形成细胞间隙连接的能力，但其形成的间隙连接是否有正常功能还有待进一步研究。