非综合征性耳聋患者12SrNRA和GJB2基因突变频谱的绘制及五个家系的临床和分子遗传学分析

摘要

目的：
　　 1．收集温州医学院附属第二医院耳鼻喉科门诊患者的临床资料，了解温州地区耳聋的发病情况。
　　 2．通过统一的调查方法、标本采集，利用基因诊断方法对门诊非综合征性耳聋(nonsyndromichearingimpairment，NSHI)患者及其家系成员进行线粒体12SrRNA基因和核基因GJB2突变检测研究，开展分子流行病学工作，绘制基因突变频谱，分析这两个基因突变在NSHI发病中的作用。
　　 3．对携带有A1555G和C1494T突变的患者进行线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)全序列的扩增，寻找新的mtDNA继发突变、多态性位点及mtDNA单体型分析。
　　 4．对5个携带线粒体DNAA1555G突变的中国汉族耳聋家系的临床、遗传和分子生物学特征进行分析，探讨新的线粒体多态性位点与耳聋的关系，为耳聋基因的调查、耳聋诊断及预防提供分子流行病学数据。
　　 方法：
　　 1．采集温州医学院附属第二医院耳鼻喉科的门诊耳聋患者血液标本169例。并进行详细的临床资料收集，建立临床和分子遗传学资料数据库。
　　 2．采集正常对照人群血液标本。
　　 3．提取所采集血液标本的基因组DNA。
　　 4．用聚合酶链反应(polymerisechainreaction,PCR)扩增技术对线粒体12SrRNA和GJB2区域进行突变筛查。
　　 5．对PCR产物纯化后直接进行测序分析。
　　 6．绘制非综合征性耳聋患者线粒体12SrRNA和核基因GJB2突变频谱。
　　 7．对5个携带线粒体DNAA1555G突变的中国汉族耳聋家系进行系谱分析，收集临床相关资料及听力学检查，分析氨基糖甙类抗生素(aminoglycosideantibiotics，AmAn)对这5个家系耳聋外显率的影响。
　　 8．对5个中国汉族耳聋家系先证者进行线粒体全基因组序列分析，寻找保守性较高的新的多态性位点，探讨其对耳聋的影响。
　　 9．对家系成员的GJB2基因的编码区进行突变检测，分析GJB2对这5个家系耳聋外显率的影响。
　　 结果：
　　 1．对已收集169例温州医学院附属第二医院耳鼻喉科的门诊患者进行线粒体12SrRNA基因突变的筛查，共检测出11个突变位点，最常见的致病位点A1555G突变筛查出20例，突变频率为11.8％;C1494T突变只检测出1例，突变频率为0.59％。
　　 2．对已收集169例温州医学院附属第二医院耳鼻喉科的门诊患者进行核基因GJB2突变的筛查，共发现22种序列改变形式，改变频率达到50.0％，其中致聋突变率为14.8％，而中国人群最常见的235delC突变率达到12.4％。同时在先证者GJB2基因中发现了另外两种致病的复合杂合突变：235delC+/-/299delAT+/-和235delC+/-/512insAACG+/-，而其父母却只有一个相应位点的杂合突变。
　　 3．我们分析了线粒体12SrRNA基因和核基因GJB2上各个突变位点与耳聋表型之间的关系；明确了温州地区NSHI门诊病例线粒体12SrRNA和核基因GJB2突变发生频率；绘制了温州地区NSHI门诊病例线粒体12SrRNA基因和核基因GJB2的突变频谱。
　　 4．我们对5个母系遗传非综合征性耳聋家系的临床、遗传特征分析后发现，其中4个家系的先证者曾经使用过AmAn。这5个家系耳聋外显率（母系成员耳聋患者/所有母系成员）分别为17.6％、50％、66.7％、31.3％、23.1％，平均外显率为37.7％，非药物致聋的外显率（非药物性聋患者/所有母系成员）分别为11.8％、33.3％、50％、31.3％、7.7％，平均外显率为26.8％。
　　 5.5个家系线粒体全序列显示家系间存在已知的A1555G突变和不同的多态性位点，分别属于东亚人群D4b2b、B4c1b1、F3、C1、D5a单体型。这5个家系没有携带已知的线粒体DNA继发突变，但发现了2个保守性较高的NDlL89T和CO3A200T突变。而且，GJB2基因上未发现与耳聋相关的突变。
　　 结论：
　　 1．我们对收集的169例温州医学院附属第二医院耳鼻喉科的门诊患者进行线粒体12SrRNA基因突变频谱的绘制发现，最常见的致病位点A1555G突变筛查出20例，C1494T突变只检测出1例，而在449名正常对照的线粒体DNA中并没有发现该突变，说明这两种突变是该地区药物性耳聋主要的致病形式。这些数据为氨基糖甙类抗生素耳毒性和非综合征性耳聋的预防和耳聋基因诊断的开展提供可靠的依据。
　　 2．我们对收集的169例温州医学院附属第二医院耳鼻喉科的门诊患者进行核基因GJB2突变频谱的绘制发现，最常见的致病位点235delC突变率达到12.4％，同时在先证者GJB2基因中发现了另外两种致病的复合杂合突变：235delC+/-/299delAT+/-和235delC+/-/512insAACG+/-，而在224名正常对照者中并没有发现该突变，说明这三种突变是该地区隐性遗传性非综合征性耳聋主要的致病形式。本项工作为隐性遗传性非综合征性耳聋的分子诊断提供了可靠的方法，对聋病产前诊断、遗传筛查和遗传咨询提供理论依据，为开展耳聋疾病的基因诊断提供流行病学数据。
　　 3．这5个母系遗传非综合征性耳聋家系中，线粒体DNA继发突变、GJB2基因可能没有影响A1555G的表型表达。然而，氨基糖甙类抗生素、线粒体DNA多态性及其他核修饰基因可能对这5个耳聋家系的表型表达起到修饰作用。