携带抑瘤基因IL-24的rDNA区靶向载体构建及抑瘤效果的初步验证

摘要

近年来，随着人类对肿瘤免疫、肿瘤病因及分子机制等研究的深入，肿瘤基因治疗获得了突飞猛进的发展，并逐渐走向成熟，获准进入临床试验的基因治疗药物逐年增多。其中载体和治疗基因的选择是其成功的关键;目前大部分基因治疗研究的载体都集中于病毒载体，我室从对双随体小染色体的研究出发，构建了一种非病毒人源基因载体系统——核糖体基因区靶向载体(pHrneo)，其后又改进构建了pHr2载体系统。我们前期研究结果表明该载体系统能在细胞内安全且稳定表达外源基因。IL-24是一个既能抑制肿瘤生长，又可调节免疫系统的基因。多项研究显示IL-24具有广泛的抗肿瘤作用，所以利用该载体结合IL-24可能会是肿瘤基因治疗的一个新策略。
　　目的:以pHrneo和pHr2两个载体构架为基础，构建能在细胞内稳定表达有生物学活性的IL-24蛋白的核糖体基因区靶向载体，并拟利用该载体对肿瘤的基因治疗进行探究。
　　方法:1.载体的构建:PCR分别扩增IL-24基因、CMV启动子和CAG启动子后连入pEGFP-N1质粒，构成与EGFP融合或者非融合表达框，再分别连入pHrneo和pHr2构架，构建出分别以CMV和CAG为启动子的两套质粒。2.构建完成的质粒用磷酸钙转染法转染293细胞，观察荧光表达情况并通过ELISA检测IL-24蛋白的表达情况。3.G418筛选转染的细胞，以获得能稳定表达IL-24蛋白的单克隆细胞。再利用Transwell技术分别与乳腺癌细胞及胶质瘤细胞共培养，用流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡情况。
　　结果:1.通过酶切和测序鉴定，表明成功将融合了EGFP蛋白和非融合EGFP蛋白的IL-24基因表达框插入到pHrneo和pHr2构架2.利用磷酸钙转染法将构建完成的质粒转入293细胞，以CMV为启动子的质粒，转染24h后即可观察到绿色荧光蛋白的表达。48h后收集混合克隆上清用ELISA进行初步检测，可检测到高达123.396±10.397ng/ml的IL-24蛋白浓度。而以CAG为启动子的质粒未见绿色荧光蛋白和未检测到IL-24蛋白的表达。3.用高浓度的G418筛选转染以CMV为启动子的实验组细胞获得稳定转染的单克隆，收集上清用ELISA可检测到高达834.963±138.111ng/ml的IL-24蛋白。4.通过ELISA结果挑选出高表达IL-24蛋白的细胞克隆与乳腺癌细胞(MCF-7)共培养后，凋亡率为6.74％明显高于对照组1.34％(p＜0.01)，但是与胶质瘤细胞(GBM-U251)共培养的实验组未见凋亡率显著升高(p＞0.05)。
　　结论:成功的构建了携带抑瘤基因IL-24的rDNA区靶向载体，初步验证该载体能把IL-24基因导入到细胞内，并在细胞内稳定表达分泌有活性的IL-24蛋白，为后续的结合干细胞打靶对肿瘤基因治疗研究打下基础。