表面等离子体激元共振研究几种生物分子的相互作用动力学

摘要

细胞色素C(Cytochrome C，Cytc)与细胞色素C氧化酶(Cytochrome C oxidase，COX)是线粒体呼吸链终端的一对酶，Cyt c是线粒体呼吸链上的电子传递体，酶存在下对组织氧化还原起快速酶促作用。COX位于细胞色素系统末端，可接受来自四个Cyt c的四个电子，并将其传递到双氧原子，将其还原为两个水分子，同时跨膜运输四个质子，这样就形成了跨膜的质子电化学势能差，从而这一势能差可以被三磷酸腺苷合酶用于制造生物体中最基本的能量分子ATP。线粒体代谢与神经疾病、肿瘤的关系引起了人们的广泛关注，所以了解Cyt c/COX的反应动力学研究对相关疾病的病理学研究具有重大意义。表面等离子体激元共振(Surface plasmon resonance，SPR)技术是是研究生物分子与其它分子相互作用的有力工具，具有高灵敏、免标记、实时检测等优点。SPR技术与电化学二者相结合后可同时检测芯片物质的电化学和光学两个方面性质的改变，且可以更好实现对芯片表面组装蛋白的控制。本课题采用氨基偶联的方法将COX固定于金膜表面，通过现场电化学技术控制Cyt c氧化/还原态，利用EC-SPR研究Cyt c与表面固定的COX之间的相互作用，通过非线性曲线拟合得到还原型Cytc/COX相互作用动力学速率常数:ka=7.68×105 mol-1·L·s-1，kd=0.0266 s-1;动力学常数Ka=3.01×107 mol-1·L，Kd=3.32×10-8 mol·L-1。氧化型Cyt c/COX相互作用的动力学速率常数:ka=4.06×104 mol-1·L·s-1，kd=0.0059 s-1;动力学常数Ka=6.84×105 mol-1·L, Kd=1.04×10-6 mol·L-1。
　　β-淀粉样多肽（amyloidβ-peptide，Aβ）是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)病理学特征——淀粉样斑块的主要成分，与AD的发生密切相关。作为传导神经突触信号的重要介质，多巴胺(dopamine，DA)、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）等小分子可与Aβ发生作用，对脑部神经元产生不同的影响。为了继续深入理解Aβ与神经传导介质小分子的相互作用对AD病理发展的影响，本论文分别研究了DA与Aβ12-25、 Aβ12-28，NE与Aβ1-16相互作用的机制，获得了相关动力学参数。研究发现，DA与Aβ疏水段的作用位点是Lys28，DA/Aβ12-28的解离常数Kd为2.92μmol·L-1;NE与Aβ作用来自NE的羟基与Aβ的Tyr10之间的氢键，NE/Aβ1-16的解离常数Kd为0.59μmol·L-1。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 细胞色素C与细胞色素C氧化酶

1．1．1 细胞色素C

1．1．2 细胞色素C的电化学性质

1．1．3 细胞色素C氧化酶

1．1．4 细胞色素C氧化酶的生物学功能

1．2 Aβ与儿茶酚胺类神经递质

1．2．1 β-淀粉样多肽与阿尔兹海默病

1．2．2 Aβ对神经细胞的作用

1．2．3 Aβ与儿茶酚胺类神经递质

1．3 表面等离子体基元共振(SPR)

1．3．1 SPR基本原理与发展历史

1．3．2 SPR芯片介绍及应用

1．3．3 SPR的应用

1．4 EC-SPR的原理及应用进展

1．4．1 EC-SPR的原理及应用

1．4．2 EC-SPR的研究进展

1．5 论文研究意义及拟开展的工作

第二章 采用EC-SPR研究Cyt c与COX的相互作用

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．3 实验过程

2．3．1 金膜及芯片制备

2．3．2 通道校正系数测定

2．3．3 Cyt C电化学行为

2．3．4 SPR动力学

2．4 结果与讨论

2．4．1 COX在芯片上的组装

2．4．2 Cyt c电化学行为

2．4．3 Cyt c与COX相互作用的动力学常数

2．5 小结

第三章 Aβ与儿茶酚胺类神经递质相互作用的动力学研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．3 实验过程

3．3．1 溶液配制

3．3．2 芯片制备

3．3．3 SPR动力学

3．4 结果与讨论

3．4．1 DA与Aβ12-25、Aβ12-28的SPR动力学研究

3．4．2 NE与Aβ1-16的SPR动力学研究

3．5 小结

总结与展望

参考文献

攻读学位期间主要研究成果

致谢