纳米金标记银染增强法快速检测痰标本中结核分枝杆菌

摘要

目的:建立一种可以在微孔板上快速检测结核分枝杆菌的纳米金标记银染增强法，并将该方法应用于临床可疑痰标本的快速检测。
　　方法:将纳米金与巯基修饰的寡核苷酸序列偶联从而制备纳米金探针。以结核分枝杆菌的IS6110基因为靶基因，分别与互补的纳米金探针、生物素探针杂交，形成三明治杂交结构。然后借链酶亲和素将靶基因锚定在酶标孔内，通过纳米金催化的银染放大效应产生高灵敏的识别信号，在酶标仪上检测其吸光度值。评价该方法的灵敏度、特异性及重复性。将该方法与培养法、PCR法对90例可疑患者痰标本进行比对检查。
　　结果:标记了巯基探针的纳米金的最大吸收峰发生了4nm红移。通过一系列优化实验建立微孔板上纳米金标记银染增强检测体系:银染增强显色最合适时间段为8min;杂交体系中生物素探针的最适浓度为100nmol/L;纳米金探针最适浓度为25nmol/L。该方法可以在显著降低非特异性背景信号的同时放大银染信号，最低检测限为1pmol/L，与所实验的其他菌株均无非特异性扩增与杂交。1nmol/L、100pmol/L和1pmol/L靶序列的批内、批间变异系数均小于7％。90例临床标本的检测结果与PCR法一致，与培养法的检测结果之间无显著性差异(P＞0.05)。
　　结论:本研究成功将巯基修饰寡核苷酸序列偶联至纳米金颗粒表面，制备了纳米金探针;成功构建了纳米金标记银染增强检测方法，可以直接应用于临床疑似肺结核患者痰标本的快速检测，具有简便快速、灵敏度高、特异性强、检测成本低等优点，适合在临床推广应用。

目录

声明

摘要

符号说明

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株来源

2．1．2 临床标本

2．1．3 主要仪器

2．1．4 主要试剂

2．1．5 试剂配制

2．2 方法

2．2．1 引物及探针设计

2．2．2 MTB基因组DNA提取

2．2．3 琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA

2．2．4 基因组DNA纯度和浓度的鉴定

2．2．5 PCR扩增

2．2．6 PCR产物纯化

2．2．7 纳米金探针的标记

2．2．8 纳米金标记银染增强显色检测体系的优化

2．2．9 方法学评价

2．2．10 临床标本的检测

2．2．11 统计学方法

3 结果

3．1 纳米金及纳米金探针的表征结果分析

3．1．1 紫外-可见分光光度计扫描纳米金及纳米金探针的表征结果分析

3．1．2 透射电子显微镜对标记巯基探针前后纳米金颗粒的形态观察

3．2 纳米金标记银染增强显色检测体系的优化结果

3．2．1 银染显色时间的优化结果

3．2．2 生物素探针的优化结果

3．2．3 纳米金探针的优化结果

3．3 方法学评价

3．3．1 灵敏度检测

3．3．2 线性范围分析

3．3．3 特异性检测

3．3．4 重复性检测

3．4 临床标本检测结果

4 讨论

4．1 纳米金在核酸检测中的应用

4．2 纳米金标记银染增强法

4．2．1 纳米金标记银染增强法的实验原理

4．2．2 纳米金探针的设计与标记

4．2．3 纳米金标记银染增强法体系的优化

4．2．4 方法学评价

4．2．5 临床标本的检测

5 结论

参考文献

综述 分子生物学技术在结核分枝杆菌诊断中的应用

攻读学位期间主要的研究成果

致谢