PCSK9对THP-1源性荷脂细胞胆固醇流出及相关蛋白SREBP-2表达的影响

摘要

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertasesubtilisin/kexin type9，PCSK9)自2003年被发现以来，大量研究证实其与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）形成关系密切。PCSK9与肝细胞表面的低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)结合，介导LDLR在细胞溶酶体降解，减少肝细胞对低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)摄取，从而使血浆中的LDL-C水平升高。PCSK9主要通过调节血浆LDL-C水平参与AS的发生。PCSK9抑制剂通过抑制PCSK9与LDLR结合而达到降脂目的，大量的临床试验结果证实其降低LDL-C水平明显，并且具有良好的安全性及耐受性。PCSK9抑制剂有望成为继他汀后最具发展前景的降脂药，2015年已有两种PCSK9抑制剂通过批准上市。然而，PCSK9促进AS形成的具体机制并不清楚，且关于PCSK9对荷脂细胞胆固醇流出的影响的研究国内外罕见报道。
　　目的:研究PCSK9对THP-1源性荷脂细胞胆固醇流出的影响，并初步探讨类固醇调节因子结合蛋白-2(SREBP-2)蛋白表达在其中的作用。
　　方法:1.建立荷脂细胞模型体外培养人单核细胞（THP-1）系细胞，用100ng/ml佛波脂(PMA)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞。50mg/l氧化性低密度脂蛋白(0x-LDL)孵育巨噬细胞24h。用油红O染色Ox-LDL孵育后的巨噬细胞，观察细胞内脂滴情况。设空白对照组（巨噬细胞组）、实验组（Ox-LDL无血清培养基孵育巨噬细胞24h）。提取蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量，将提取的蛋白样品上样于高效液相色谱仪，检测细胞内总胆固醇(TC)、胆固醇脂(CE)、游离胆固醇(FC)的含量，建立荷脂细胞模型。
　　2.22-NBD-胆固醇对荷脂细胞的影响22-NBD-胆固醇孵育荷脂细胞，倒置荧光显微镜下观察细胞对胆固醇摄取情况。不同浓度22-NBD-胆固醇（0.1mg/l，1mg/l，5mg/l）孵育荷脂细胞，并在(0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h)用多功能酶标仪检测细胞内22-NBD-胆固醇含量。
　　3.PCSK9对荷脂细胞胆固醇流出率的影响:实验设计分为空白对照组（巨噬细胞）、阴性对照组（荷脂细胞）、5个实验组(荷脂细胞+0.01ug/ml、0.05ug/ml、0.1ug/ml、0.5ug/ml、1ug/ml PCSK9)，将各组细胞分别用22-NBD-胆固醇、高密度脂蛋白（HDL）处理后，用多功能酶标仪分别检测培养基和细胞中的22-NBD-胆固醇含量，计算胆固醇流出率。
　　4.PCSK9与Atorvastatin对荷脂细胞胆固醇流出率的影响:实验分为5个组:空白对照组（巨噬细胞组）、阴性对照组（荷脂细胞组）、3个实验组（0.1ug/ml PCSK9组、0.1 ug/ml PCSK9+0.1 umol/L Atorvastatin组、0.1 ug/ml PCSK9+10umol/L Atorvastatin组）。将培养的细胞用22-NBD-胆固醇(5 mg/L)无血清培养基培养，然后将预先配置好的PCSK9、Atorvastatin加入实验组细胞，再在各组中加入50mg/L HDL的无血清培养基培养。6h后用多功能酶标仪分别检测培养基和细胞中的22-NBD-胆固醇含量，计算胆固醇流出率。
　　5.SREBP-2蛋白的相对表达:实验设计分空白对照组（巨噬细胞）、阴性对照组（荷脂细胞）、实验组(0.1ug/ml PCSK9作用于荷脂细胞24h组)。用western blot法检测各组SREBP-2蛋白表达情况。
　　结果:1.用PMA诱导THP-1后分化为巨噬细胞，再用Ox-LDL孵育细胞后，高效液相色谱仪测得CE/TC百分比为36.18±5.11％，大于20％且小于50％，成功建立荷脂细胞模型。
　　2.不同浓度22-NBD-胆固醇处理荷脂细胞后，荷脂细胞摄取胆固醇含量在6h进入平台期，发现5mg/l22-NBD-胆固醇组细胞摄取胆固醇含量最多（P＜0.05）。
　　3.不同浓度PCSK9干预的荷脂细胞胆固醇流出率随浓度的增加而降低，与阴性对照组比较，实验组胆固醇流出率明显降低（P＜0.05）;0.1ug/ml PCSK9组胆固醇流出率为20.60±2.07％，与其他各实验组比较有统计学意义（P＜0.05）。
　　4.PCSK9与Atorvastatin共同干预荷脂细胞，与阴性对照组比较，胆固醇流出率明显降低（P＜0.05）;实验组中，0.1 ug/mlPCSK9+10umol/L Atorvastatin组胆固醇流出率为10.24±1.44％，与0.1ug/ml PCSK9组比较，具有统计学意义（P＜0.05）。
　　5.PCSK9作用于荷脂细胞后，与空白对照组比较，荷脂细胞内SREBP-2蛋白表达上调（P＜0.05）。
　　结论:1.PCSK9能有效抑制THP-1源性荷脂细胞胆固醇流出，PCSK9与Atorvasttin能更有效抑制THP-1源性荷脂细胞胆固醇流出。
　　2.PCSK9抑制胆固醇流出，其作用可能与SREBP-2蛋白表达上调有关。

目录

摘要

第一章 引言

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞来源

2．1．2 主要药品及试剂来源

2．1．3 主要仪器

2．2 主要实验方法

2．2．1 主要试剂的配制

2．2．2 细胞培养

2．2．3 建立荷脂细胞模型

2．2．4 荷脂细胞对22-NBD-胆固醇的摄取

2．2．5．PCSK9对荷脂细胞胆固醇流出率的影响

2．2．6 PCSK9与Atorvastatin对荷脂细胞胆固醇流出率的影响

2．2．7 Western-blot检测细胞内SREBP-2蛋白表达水平

2．2．8 统计学处理

第三章 结果

3．1 荷脂细胞模型建立

3．1．1 THP-1细胞系巨噬细胞的诱导

3．1．2 油红O染色

3．1．3 细胞内胆固醇含量测定

3．2 荷脂细胞对22-NBD-胆固醇的摄取

3．3 PCSK9对荷脂细胞胆固醇流出率的影响

3．4 PCSK9与Atorvastatin对荷脂细胞胆固醇流出率的影响

3．5 Western blot检测细胞内SREBP-2蛋白表达水平

讨论

结论

参考文献

综述

英文缩写词表

攻读硕士学位期间的主要研究成果

致谢

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