一氧化氮处理下水稻幼苗叶片全基因组差异基因表达谱分析

摘要

一氧化氮（Nitric oxide，NO）是一种带自由基性质的气态激素，具有高度反应活性和膜透性。植物不仅对外源NO作出反应，而且能自身合成NO。近年来的研究发现，NO在植物生长、发育及胁迫响应中发挥重要作用。基于高通量DNA芯片技术的基因表达谱分析已被广泛应用于植物生长、发育和胁迫响应机制研究中，并取得了重大进展。然而，NO处理下水稻全基因组差异基因的表达谱分析未见报道。
　　本研究采用水稻全基因组cDNA微阵列（Agilent rice oligo microarray，4×44k），对NO处理后1（T1）、6（T6）和12h（T12）水稻幼苗叶片全基因组基因的表达谱进行了分析。结果表明，在任1个时间点有3倍或以上表达变化的基因有3852个，在3个时间点中至少两个时间点有3倍或以上表达变化的NO响应基因1195个。基因功能分析和代谢通路分析表明，NO响应基因主要参与了胁迫响应、氧化还原、次级代谢、生物合成等生理过程。实时荧光定量PCR验证结果与芯片杂交结果基本一致，印证了芯片杂交结果的有效性。该研究为阐明NO在植物生理过程中的作用机制提供了理论依据。
　　NO信号分子与WRKY转录因子均参与植物抗逆、发育与代谢等许多生理过程。为了探讨NO信号是否参与WRKY蛋白介导的生理调节功能，本研究另对NO处理下水稻WRKY基因家族的表达谱作了系统分析。鉴定出在1个时间点有两倍或以上表达变化的差异表达的WRKY基因32个，主要分布在WRKY的I和II组，其中75％的IIa和45.6%的IId亚组成员为差异表达基因。鉴定出3个时间点至少在2个时间点有两倍或以上表达变化的NO响应的WRKY基因15个，均为早期（1h）应答，且多数（64.2%）持续上调。基因功能预测分析表明，NO响应的WRKY基因主要参与生物学过程中的代谢过程、刺激响应和细胞过程，以及分子功能中的转录调节活性和结合。代谢通路分析表明，WRKY24参与植物与病原菌互作代谢通路。上述发现提示，NO信号可能参与了WRKY转录因子介导的生物学调控功能，并为下一步这些WRKY基因的功能分析奠定了基础。

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第一章 绪论

1.1 一氧化氮在植物中的生理作用研究进展

1.1.1 一氧化氮的化学性质

1.1.2 一氧化氮在植物中的来源

1.1.3 一氧化氮在植物中的生理功能

1.1.4 一氧化氮处理下植物全基因组尺度下的基因表达分析

1.2 基因芯片技术及其在植物基因表达分析中的应用

1.3 WRKY转录因子的研究进展

1.3.1 WRKY转录因子的结构和分类

1.3.2 WRKY转录因子的功能

1.3.4 水稻全基因组的WRKY基因表达谱研究

1.4 研究目的与意义

第二章 NO处理下水稻全基因组差异基因表达谱分析

2.1 实验材料

2.1.1 水稻材料与芯片

2.1.2 主要仪器与试剂

2.2 实验方法

2.2.1 水稻材料培养与硝普钠处理

2.2.2 叶绿素含量测定

2.2.3 RNA提取、纯化和反转录

2.2.4 芯片杂交和数据标准化

2.2.5 数据筛选、聚类和功能分类

2.2.6 qRT-PCR分析

2.3 结果与分析

2.3.1 微阵列数据相关性分析

2.3.2 NO处理下各时间点水稻叶片叶绿素含量测定

2.3.3 NO处理下差异表达基因分析

2.3.4 NO响应基因的鉴定

2.3.5 NO响应基因的GO分析

2.3.6 NO响应基因的pathway分析

2.3.7 NO响应基因的表达规律分析

2.3.8 NO响应基因的主要功能分类

2.3.9 基因表达水平的qRT-PCR验证

2.4 讨论

第三章 水稻WRKY转录因子基因家族响应外源一氧化氮的表达谱分析

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.3.1 NO处理下WRKY基因的差异表达分析

3.3.2 NO响应的WRKY基因的GO分析和通路分析

3.3.3 NO响应的WRKY基因的表达聚类分析

3.3.4 基因表达水平的qRT-PCR验证

3.4 讨论

第四章 结论与展望

4.1 主要结论

4.2 展望

参考文献

致谢

附录A（攻读学位期间发表论文目录）

附录B（附加数据）