拟南芥DBB亚家族基因表达的光调控和DBB1a基因功能分析

摘要

光是植物生长发育的最重要的环境因子,在植物种子萌发、光形态建成,成花诱导等多个过程中起重要调节作用。发掘光信号途径的调控元件对全面了解和利用植物光信号途径具有重要意义。B-box结构域在拟南芥(Arabdiopsis)光信号传导中发挥着重要的功能。DBB(Double B-box)亚家族基因编码一类N端具有多个B-box结构域的锌指蛋白,该家族有部分成员被证实参与光形态建成,但是大多数成员的功能仍不清楚。本研究通过生物信息学和实时定量PCR方法对拟南芥DBB亚家族基因转录表达的光调控和长短日照下生物钟节律性进行分析,在此基础上进一步对DBB1a基因的功能、该基因与隐花色素介导信号传导途径的关系进行了详细研究,获得了如下下主要研究结果:
　　 (1)分析了DBB基因亚家族的序列特征及其表达的光调控特性。通过生物软件plantcare分析DBB基因亚家族的启动子区域,发现DBB基因亚家族成员除DBB3外,都含有光响应相关的顺式作用元件G-box。整合微阵列数据和采用实时荧光定量PCR分析拟南芥锌指蛋白DBB亚家族中8个基因在不同光周期和不同光质条件下转录表达的结果,发现在长日和短日照条件下DBB基因亚家族中6个基因的转录都具有光周期节律性,并且其中4个基因的表达受光诱导,有1个基因的表达受光抑制,1个基因的表达不受光调节,其余2个基因的表达没有生物钟节律并且受光诱导不明显;不同光质光对DBB基因亚家族中各个基因的表达调控的趋势相似。
　　 (2)阐明了DBB1a基因的亚细胞定位和组织表达特征。利用35S::DBB1a-GFP表达载体在洋葱表皮细胞瞬时表达实验,以及35S::DBB1a-GFP拟南芥转基因植株稳定表达分析实验,结果发现:DBB1a蛋白在细胞核中表达。利用基因启动子驱动GUS报告基因的方法,获得pDBB1a:GUS拟南芥转基因植株,观察DBB1a基因的组织表达模式,结果发现:GUS染色在刚萌发的种子、子叶、幼苗、叶脉、叶柄和花等组织器官中有活力。实时定量PCR方法检测DBB1a基因在拟南芥不同组织和器官中表达的结果与启动子驱动GUS的研究结果基本一致。
　　 (3)阐明了不同光受体突变体中DBB1a基因的表达特征。利用实时定量PCR的方法,分析在持续红光培养条件下红光受体双突变体phyAphyB及持续蓝光培养条件下蓝光受体双突变体cry1cry2与野生型中DBB1a基因的表达差异,发现DBB1a基因的转录调节主要受蓝光受体CRY的介导,其表达量随蓝光照强度增加和时间延长而增加。此外,通过分析cry1cry2材料中连续3 d的DBB1a基因表达,发现DBB1a基因的生物钟节律表达受到CRY的调控。
　　 (4)发现了DBB1a蛋白与蓝光受体CRY2光信号途径下游信号分子COP1存在相互作用。通过酵母双杂交的方法,发现DBB1a蛋白与拟南芥蓝光受体CRY2不能直接相互作用,但能与光信号途径中的关键分子COP1相互作用,说明CRY2与DBB1a的相互调节可能部分通过COP1介导。
　　 (5)发现了DBB1a基因抑制拟南芥植株早期的光形态建成。通过分析DBB1a基因过量表达和抑制表达的拟南芥转基因株系的表型,发现在蓝光培养条件下DBB1a基因对下胚轴的伸长有明显的促进作用,而在远红光和红光培养条件下,促进作用不明显。在DBB1a基因过量表达的转基因株系中叶绿素含量明显降低,通过实时定量PCR的方法检测进一步发现,DBB1a基因抑制叶绿素合成的关键基因叶绿素a/b绑定蛋白2(CAB2)的转录表达。此外,DBB1a基因还抑制光信号途径关键基因查尔酮合成酶(CHS)基因的转录表达。结果表明:DBB1a基因是光形态建成的负调控因子。
　　 (6)DBB1a基因影响拟南芥植株开花时间和花的发育。在短日照培养条件下DBB1a基因抑制表达突变体dbb1a能提前开花,而长日照培养条件下不能提前开花。DBB1a过量表达转化株系则在长、短日照条件下开花时间都正常。同时,还发现突变体dbb1a中花的发育异常,例如:每朵花的花瓣数少至2片,多达13片,而正常植株均为4片。实时定量PCR实验结果证明,主要由于突变体dbb1a中FT基因和LFY基因表达量增加而导致提前开花,而多个花发育相关基因,如:AP2、AP3、PI、AG和miR172表达量的增加而导致花发育异常。
　　 (7)发现DBB1a基因参与拟南芥的赤霉素信号传导和CRY介导的光信号传导途径。通过比较蓝光培养条件下拟南芥野生型、DBB1a基因过量表达和DBB1a基因抑制表达突变体的下胚轴对添加外源有生物活性的GA3以及GA生物合成抑制剂多效唑(paclobutrazol)的反应,以及对DBB1a基因各类突变体中赤霉素合成与代谢相关基因GA2ox1、GA3ox1和GA20ox1的转录表达水平分析,结果发现:DBB1a基因调节的下胚轴伸长与促进赤霉素的合成相关。
　　 (8)筛选以cry1cry2为遗传背景的激活标签突变体体库获得SCC98-D株系,实验发现SCC98-D株系恢复了cry1cry2表型,但出现了花发育异常表型。通过TAIL-PCR和RT-PCR方法对SCC98-D株系进行分析,发现T-DNA插入位点所在基因18srRNA可能与DBB1a基因的表达相关,并且DBB1a基因的表达量在SCC98-D中比在cry1cry2中明显增加。这个结果进一步说明DBB1a基因参与CRY介导的光信号传导途径。