基于金纳米颗粒的光学生物分析新方法研究

摘要

生物传感器是以待测的目标物与生物识别元件(蛋白质、核酸、酶、微生物、细胞、组织等)特异性结合后，发生物理或化学反应，通过转换元件(压电石英晶体、电化学电极、光学检测元件等)转换为可以输出的光信号或电信号，从而实现对目标物分析和检测的一种检测器。能提高识别和转化组件效率的新型纳米材料的发展，为高效率传感器的设计提供了新的发展思路。具有特殊物理化学性质的纳米材料拓展了识别和转化过程，使传感器微型化的同时也提高了传感器的信噪比。具有独特光学性质、电学性质和生物相容性的纳米金，为生物传感器的研究和应用开辟了一个广阔的天地，在生化分析中得到广泛的应用。本论文以纳米金为平台来构建新型生物传感器，用于参与各种生理和病理调控的的高活性氧物质、食品安全问题中涉及的三聚氰胺及参与细胞DNA损伤修复的T4多聚核苷酸激酶的简单、快速、灵敏检测。具体内容如下：
　　1.本章利用高活性氧物质与荧光金纳米簇表面起到稳定剂和还原剂作用的牛血清蛋白发生相互作用，导致金纳米簇表面发生改变，进而荧光光谱特征随之改变；而这种荧光改变的程度依赖于高活性氧物质的浓度，在一定高活性氧浓度范围内，荧光的改变与高活性氧物质的浓度呈线性关系，据此实现对高活性氧物质羟基自由基(·OH)、过亚硝酸根(ONOO-)、次氯酸根(ClO-)的简单、灵敏检测。·OH的线性检测范围在0.01到5μM，ONOO-的线性范围为0.5-100μM，而ClO-的线性范围为1-150μM。该方法采用的荧光金纳米簇制备简单，对高活性氧物质的响应快速灵敏且具有较高的选择性。
　　2.本章基于纳米金颗粒存在状态差异引起的表面增强拉曼散射(SERS)不同的增强效果，实现对分析物三聚氰胺的检测。三聚氰胺可以和胸腺嘧啶通过氢键作用形成类似T-Hg-T双链性质的发夹结构。本章利用这个反应，首先在大小为30nm的纳米金表面通过静电吸附polyT24的单链DNA，单链DNA分子能够稳定纳米金颗粒，使其在一定盐离子浓度下以单分散的状态存在。加入三聚氰胺后，三聚氰胺和胸腺嘧啶形成的复合物不再保护纳米金，纳米金在相同的盐离子存在下就发生团聚。纳米金在分散和团聚的不同状态下对SERS的增强效应不同，以此来实现对三聚氰胺的检测。实验结果表明，对三聚氰胺的检测动态线性范围宽达三个数量级，从0.01到10μM，检测下限为18 nM。
　　3.本章基于寡核苷酸修饰的纳米金颗粒和核酸外切酶的酶切反应，构建了一种简单的纳米金比色传感方法用于检测T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)的活性。在没有T4 PNK存在下，不发生任何的酶切反应，纳米金探针受到核酸链的保护可以承受一定盐离子浓度，溶液呈红色的单分散状态。加入T4 PNK后，5’羟基末端的碱基被磷酸化，激活λ外切酶从5'开始逐步切去磷酸化的分子信标stem部分，释放出环状单链DNA片段，之后RecJ外切酶从5’到3’方向水解剩余的单链DNA。因为纳米金表面起稳定作用的DNA全部被酶切消化，纳米金在相同的盐离子浓度下发生团聚，溶液由红色变成紫色。结果显示，本章的方法可以实现对T4 PNK的简单、快速灵敏响应，检测线性范围为0到4.0U/mL，根据空白的三倍标准方差原则计算得到检测下限为0.24 U/mL。

目录

文摘

英文文摘

第1章 绪 论

1.1 纳米材料

1.2 各种纳米金的制备方法

1.2.1 柠檬酸及其他还原剂的化学还原法

1.2.2 Brust-Schiffrin法制备硫醇保护的纳米金

1.2.3 物理方法

1.2.4 聚合物稳定的纳米金制备

1.2.5 模板法制备荧光金纳米簇

1.3 纳米金的性质

1.4 纳米金的应用

1.4.1 基于纳米金的比色分析法

1.4.2 基于纳米金的荧光分析

1.4.3 基于纳米金的电化学和电催化分析

1.4.4 纳米金在SPR传感器中的应用

1.4.5 纳米金在表面增强拉曼散射分析中的应用

1.5 本论文构思

第2章 基于荧光金纳米簇的荧光猝灭灵敏检测高活性氧物质

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 反应试剂和仪器

2.2.2 发光金纳米簇的制备

2.2.3 发光金纳米簇的表征

2.2.4 不同活性氧物质的制备

2.2.5 高活性氧物质的测定

2.3 结果与讨论

2.3.1 基于发光金纳米簇荧光猝灭检测高活性氧物质的原理

2.3.2 发光金纳米簇的性质考察

2.3.3 金纳米簇对活性氧物质的选择性响应

2.3.4 金纳米簇浓度的优化

2.3.5 基于金纳米簇的荧光猝灭传感技术对高活性氧物质的检测

2.3.6 探针的选择性考察

2.4 小结

第3章 表面增强拉曼光谱用于牛奶中三聚氰胺的检测

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂与仪器

3.2.2 纳米金的制备

3.2.3 三聚氰胺的检测

3.2.4 牛奶实际样品的准备

3.3 结果与讨论

3.3.1 检测原理

3.3.2 基于免标记的SERS传感器用于三聚氰胺的检测的表征

3.3.3 检测条件的优化

3.3.4 三聚氰胺的检测

3.3.5 三聚氰胺的干扰实验及实际样品的检测

3.4 小结

第4章 纳米金比色法检测T4多聚核苷酸激酶活性

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂和仪器

4.2.2 纳米金的制备

4.2.3 硫辛酸修饰氨基标记的DNA链

4.2.4 寡核苷酸链修饰的纳米金的制备

4.2.5 T4 PNK活性检测

4.3 结果与讨论

4.3.1 实验原理

4.3.2 传感器的表征

4.3.3 实验条件的优化

4.3.4 T4 PNK的检测

4.4 小结

结 论

参 考 文 献

附录A 攻读学位期间发表的学术论文

致 谢