斑马鱼小maf的时空表达分析及其在血红素调控胰外分泌酶原基因表达中的作用研究

摘要

Maf（musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene）蛋白家族作为重要的转录调控因子，参与细胞众多生命进程，分为大Maf蛋白和小Maf蛋白，小Maf蛋白缺乏转录激活域，需要与其它bZip(basic and leucine zipper)家族蛋白结合形成异二聚体，并识别基因上游的MARE(MAF recognition element)位点从而调控基因的转录。斑马鱼中，小Maf包括MafK、Mafg1、Mafg2和MafT，mafg1和mafg2是mafg在鱼类中特有的分化出的两个旁系同源基因，MafG1和MafG2之间的相似性达到了88％。本文研究了这类斑马鱼小maf基因的时空表达模式及其对下游基因表达的影响，它对鱼类maf旁系同源基因的分子进化及功能歧化研究具有重要意义。 本实验对以上四个基因克隆结果显示，mafk基因的开放阅读框包括465个碱基，编码154个氨基酸;mafg1基因的开放阅读框包括489个碱基，编码162个氨基酸;mafg2基因的开放阅读框包括516个碱基，编码171个氨基酸;maft基因的开放阅读框包括477个碱基，编码158个氨基酸。多重序列比对以及系统发育树结果显示，小Maf进化上比较保守，MafK、MafG、MatF各自聚为一支后再聚为一组。染色体线性关系分析结果显示mafk和maff在物种间的更趋于保守，mafg比前两者要相对活跃。 有研究证实，四个小Maf之间存在功能叠加和可替换，RT-PCR结果显示，四个小maf在斑马鱼的各个组织中广泛表达，胚胎发育后期都能检测到表达，但是对其生长发育过程中的时空表达模式尚未见报道。本实验利用半定量和胚胎整体原位杂交技术，选取斑马鱼胚胎发育十个不同时期(1cell、2cell、3.5hpf、6hpf、12hpf、24hpf、36hpf、48hpf、72hpf、96hpf)，对其表达模式进行了详细的研究，结果显示四个小maf中，mafg2的表达量最高，maft和mafk的表达量次之，mafg1的表达量最低。四个基因除了表达部位主要集中在头部之外，mafg2和maft在胚胎发育的后期，躯干部和尾部还有表达，而mafk和mafg1则在躯干和尾部没有发现表达信号。此外，值得一提的是，鱼类中mafg两个旁系同源基因mafg1和mafg2的表达量和表达模式有明显的不同，这充分说明了mafg在鱼类基因组进化中较活跃。 已有的研究表明，血红素是Maf-Nrf2/Bach1信号通路的上游调控因子，血红素的缺乏能导致胰外分泌酶原基因的表达下调，但是对其具体调控机制研究不多见。为揭示血红素是否通过Maf-Nrf/Bach1信号通路来调控胰外分泌酶原基因的表达，本实验通过构建重组载体，采用双荧光素酶检测体系，体外转染人293细胞和鲤鱼EPC细胞，探究Maf-Nrf2/Bach1通路中的三个组分对胰外分泌酶原基因表达的调控作用。结果显示，转染人293细胞时，胰外酶原基因(tryl)的表达受血红素类似物Hemin的调节，随着Hemin剂量的升高先升高后降低，在Hemin剂量为10μM和20μM时，与对照组相比，胰外分泌酶原基因的表达量显著上调;胰外分泌酶原基因(try)的表达量同时还受Nrf2a和Maf的调节，与对照组相比，超表达不同量的nrf2a(转染量依次为250ng、500ng和750ng)，在nrf2a的转染量为250ng时try的表达显著上调，转染量为500ng时try的表达极显著上调;而四个小maf的超表达都使胰外分泌酶原基因try的表达下调，并且高转染量(250ng)的mafk使胰外分泌酶原基因的表达显著下调后不能被Nrf2a和Hemin恢复，而低转染量(50ng)的mafk在使胰外分泌酶原基因的表达显著下调后可以被Nrf2a部分恢复;虽然转染鲤鱼EPC细胞时，胰外分泌酶原基因try的表达也具有Hemin剂量依赖性，但是try的表达量随着Hemin处理剂量的增高而下降，与转染293细胞得出来相反的结果，其原因有待于进一步研究;转染鲤鱼EPC细胞时，四个小maf的超表达，也都会使胰外分泌酶原基因try的表达得到不同程度的下调，与转染293细胞结果一致。

目录

声明

摘要

1前言

1．1 Maf蛋白家族简介

1．2小Maf蛋白研究进展

1．2．2与小Maf有关的血红素

1．2．3小Maf在其它方面研究进展

1．3本研究目的及意义

2．1实验材料

2．1．1实验材料的来源和饲养

2．1．2工具酶

2．1．3载体

2．1．4试剂盒

2．1．5主要生化试剂

2．1．6细胞培养基及转染试剂

2．1．8主要仪器及设备

2．1．9引物序列

2．1．10主要实验试剂的配制

2．2实验方法

2．2．1实验材料的处理和收集

2．2．2 Trizol法提取斑马鱼总RNA

2．2．4小Maf基因的开放阅读框PCR扩增

2．2．5小Maf基因探针序列PCR扩增

2．2．6斑马鱼基因组DNA的提取

2．2．7胰外分泌酶原基因上游调控区的PCR扩增

2．2．8 PCR产物切胶回收

2．2．9感受态细胞DH5α的制备

2．2．10目的片段与载体的连接

2．2．11连接产物转化到DH5α感受态细胞中及蓝白斑筛选阳性克隆

2．2．12序列分析

2．2．13斑马鱼胚胎整体原位杂交技术

2．2．14半定量研究四个小maf基因时空表达

2．2．15体外实验研究转录因子之间的相互作用

2．2．16细胞转染

2．2．17双荧光素酶试剂盒对实验结果进行的测定

3实验结果分析

3．1．1四个小maf基因开放阅读框全长的克隆

3．1．2四个小Maf同源性分析

3．1．3四个小Maf系统进化分析

3．1．4四个小maf同线性关系分析

3．2四个小maf时空表达分析

3．2．2四个小maf时空表达研究

3．3小Maf对胰外分泌酶原基因的调节作用

3．3．1超表达载体的构建

3．3．2荧光素酶载体的构建

3．3．3离体研究Bach／Nrf路径在调控胰外分泌酶原表达中作用

4．讨论

4．2四个小maf时空表达分析

4．3小Maf对胰外分泌酶原基因的调节作用

4．4展望

参考文献

研究生期间学术论文已发表及待发表情况

致谢

附录