非洲绿猴肾细胞中SARS冠状病毒受体血管紧张素转换酶2cDNA的克隆、表达及功能区的鉴定

摘要

2002年末至2003年春在世界范围爆发的非典型肺炎给人们的正常生活产生了巨大的影响，也引起了各国科研工作者的高度关注。非典型肺炎是一种急性、高度接触性的呼吸系统疾病，世界卫生组织(WHO)于2003年3月15日将其正式定名为严重急性呼吸综合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)。目前已经确定，冠状病毒(coronavirus)的一个变种是引起SARS的病原体，并将其命名为SARS病毒(SARS-CoV)。SARS-CoV的细胞受体已鉴定为血管紧张素转换酶2(angiotensin-convertingenzyme2，ACE2)。尽管CD209L也被认为是SARS-CoV的细胞受体，但血管紧张素转换酶2(ACE2)是SARS-CoV的主要功能性受体。ACE2是一种具有重要生物学功能的金属蛋白酶。本研究旨在克隆鉴定ACE2，确定ACE2的受体功能域，为进一步研究SARS-CoV与细胞的相互作用及跨种感染机制、研制抗病毒制剂等提供理论依据与实验基础。 1.SARS-CoV受体ACE2在巴斯德毕赤酵母中的表达本研究参照人ACE2的全基因序列合成两对特异性引物，从SARS-CoV敏感细胞Vero-E6细胞的mRNA中分两段扩出ACE2基因，命名为(ACE2A：102nt～1210ntACE2B：1101nt～2524nt)，然后克隆到pMD-18T中，酶切鉴定后，用SnaBI和NotI酶切，将其插入毕赤酵母表达载体pPIC9k中，得到的重组表达载体p9K-ACE2A与p9K-ACE2B，转化GS115感受态细胞，经甲醇诱导5天表达ACE2A、ACE2B蛋白，并分泌到胞外。SDS-PAGE分析显示表达的蛋白大小约为41KD、52KD。Dot-blot结果表明表达蛋白具有良好的抗原性。这对于ACE2SARS-CoVS蛋白结合区的鉴定及SARS-CoV的临床检测都具有十分重要的意义，也为深入研究SARS-CoV与细胞受体的结合机制奠定了基础。 2.SARS-CoV受体ACE2的原核表达及其功能区的鉴定从Vero-E6细胞的mRNA中分两段扩出的ACE2基因(ACE2A：102nt～1210ntACE2B：1101nt～2524nt)，前段ACE2A1-367不包括ACE2的酶活性位点，后段ACE2B335-805包括ACE2的酶活性位点。构建与GST基因融合表达的原核表达质粒pGEX-ACE2A与pGEX-ACE2B，IPTG诱导下获得高效表达。表达的融合蛋白分子量为65KD和77KD，主要以包涵体形式存在。Westernblot证实表达产物具有免疫学活性。将包涵体变性、复性后，经Westernblot证实pGEX-ACE2A表达的蛋白(～65KD)能与SARS-CoVS1蛋白特异结合，而pGEX-ACE2B表达的蛋白(～77KD)不能与S1蛋白结合。此结论证实ACE2的受体活性与酶活性位点无关，受体功能区在ACE2N端335位氨基酸内。该研究是目前表达的、具有受体活性的最小ACE2片段。 3.应用噬菌体展示技术预测SARS-CoVS蛋白的功能区本研究采用噬菌体展示(phagedisplay)技术筛选与ACE2A(因为已经鉴定出ACE2的功能区是ACE2A这一段)蛋白结合的短肽。ACE2A蛋白与GST融合蛋白应用pGEX-KG载体系统表达，并通过提取包涵体纯化。用浓度为100μg/mlACE2A-GST蛋白4℃下包被ELISA板过夜，并用含有5mg/mlBSA的0.1MNaHC03(pH8.6)封闭1h后，加入10μL的噬菌体12肽随机肽库进行第一轮淘筛(panning)，共淘筛三次，去除库中与GST结合的噬菌体。再用ACE2A-GST融合蛋白(包被质量浓度为100μg/ml)以同样方法进行筛选。经过3轮筛选，可以明显地看到特异结合的噬菌体得到富集。 三轮筛选后，随机挑选20个噬菌斑，分别进行噬菌体扩增并纯化噬菌体DNA进行序列测定，经过鉴定得到7个短肽序列将此氨基酸序列。与S蛋白的氨基酸序列经BLAST软件进行比对分析，结果发现其中2个序列与S蛋白的受体结合区S318-510有较高的同源性。尽管该多肽与S蛋白及ACE2的相互关系有待进一步确定，该结果为深入研究奠定了基础。

目录

摘要

第1章文献综述

1.1 SARS病毒概述

1.1.1冠状病毒的特点

1.1.2 SARS-CoV的基因结构和功能

1.1.3 SARS-CoV的变异特性

1.2冠状病毒受体简介

1.2.1 Ⅰ型冠状病毒受体

1.2.2 Ⅱ型冠状病毒受体

1.2.3 Ⅲ型冠状病毒受体

1.2.4 SARS冠状病毒的受体

1.3噬菌体展示技术的优越性

第2章SARS-CoV受体ACE2在巴斯德毕赤酵母中的表达

2.1研究目的和意义

2.2材料和方法

2.2.1材料

2.2.2实验方法

2.3结果与分析

2.3.1 PCR产物的克隆

2.3.2酵母表达质粒p9K-ACE2A、p9K-ACE2B的构建

2.3.3 p9K-ACE2A、p9K-ACE2B重组入酵母染色体的PCR鉴定

2.3.4重组酵母菌上清的SDS-PAGE及斑点杂交鉴定

2.4讨论

第3章SARS病毒受体ACE2的克隆、原核表达及其功能区的鉴定

3.1研究的目的意义

3.2材料和方法

3.2.1材料

3.2.2实验方法

3.3结果与分析

3.3.1 ACE2A、ACE2B基因的PCR扩增、克隆及表达载体的构建

3.3.2 ACE2A、ACE2B的不同诱导时间的表达情况

3.3.3表达产物的检测及鉴定

3.3.4蛋白的纯化

3.3.5ACE2A蛋白与S1蛋白的结合

3.4讨论

第4章应用噬菌体展示技术预测SARS-CoV S蛋白的功能区

4.1研究的目的意义

4.2材料和方法

4.2.1材料

4.2.2实验方法

4.3结果与分析

4.3.1 ACE2A的亲和筛选

4.3.2噬菌体克隆的特异性鉴定

4.3.3所筛选出的7个多肽与S蛋白的氨基酸进行BLAST比对

4.4讨论

参考文献

致谢