橘林油脂酵母△9-和△15-脂肪酸去饱和酶基因的克隆及功能验证

摘要

脂肪酸是人类重要的营养来源，其中的多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids，PUFAs）是人体重要的生理活性物质。多不饱和脂肪酸中的亚油酸（Linoleic acid，LA）和α-亚麻酸（α-linoleic acid，ALA）是人体的必需脂肪酸，为人体合成下游长链PUFAs所必需。利用微生物发酵法生产PUFAs，不仅具有成本低廉、生产周期短以及受环境影响小等优点，而且更是生产长链的稀缺PUFAs的重要资源。
　　本研究以橘林油脂酵母（Lipomyces kononenkoae）为实验材料，克隆与亚油酸和α-亚麻酸合成相关的△9-和△15-脂肪酸去饱和酶基因（lkfad9和lkfad15），并验证功能。主要得到以下结果：
　　1.通过对培养基成分和培养条件的优化试验，找出橘林油脂酵母发酵生产PUFAs的主要影响因素，确定其高产PUFAs的最优化培养基及培养条件。
　　2.利用脂肪酸去饱和酶（Fatty Acid Desaturase，FAD）的保守区域设计简并引物，克隆橘林油脂酵母△9-和△15- FAD的核心编码序列，并采用基因组步移及逆转录PCR等技术，克隆了两个基因完整结构基因序列。生物信息学分析，两个基因均属于脂肪酸脱氢酶超家族，与其他酵母中相应的FAD具有较高同源性。
　　3.将基因 lkfad15分别转入毕赤酵母（Pichia pastoris) GS115和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）INVScI，发酵重组酵母，诱导外源基因表达后收集菌体，气相色谱分析重组菌株的脂肪酸成分。结果显示，基因 lkfad15能通过催化LA变为ALA而提高毕赤酵母GS115中ALA的含量（从4.68％增加到21.93%），并且能仅利用油酸作为底物，在酿酒酵母INVScI中产出LA和ALA，这个结果显示lkfad15同时具有△12-和△15-FAD的活性。
　　本研究证实了橘林油脂酵母△15-脂肪酸去饱和酶基因 lkfad15同时具有△12-和△15-FAD脱氢作用的双功能，为利用双功能的脂肪酸去饱和酶LKFAD15在转基因生物中富集ω-3系列多不饱和脂肪酸提供了重要的应用基础。

目录

声明

英文缩略表

第一部分 文献综述

1.1 多不饱和脂肪酸概述

1.2 脂肪酸去饱和酶的研究概况

1.3 真菌产油脂的研究现状

1.4 脂肪酸去饱和酶的异源表达

1.5 本课题研究的内容和意义

第二部分 高产多不饱和脂肪酸的酵母培养基的优化

2.1 引言

2.2 材料和设备

2.3 正交试验（Orthogonal Experiment）

2.4 菌体的收集和处理

2.5 气相色谱分析（Gas Chromatography，GC）

2.6 正交试验和极差分析的结果

2.7 分析和结论

第三部分 橘林油脂酵母△9-和△15-脂肪酸去饱和酶基因的克隆

3.1 引言

3.2 材料和设备

3.3 实验方法

3.4 结果与分析

3.5 小结

第四部分 橘林油脂酵母△15-脂肪酸去饱和酶基因lkfad15的异源表达

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 △15-脂肪酸去饱和酶基因lkfad15转化酿酒酵母INVScI

4.4 △15-脂肪酸去饱和酶基因lkfad15转化毕赤酵母GS115

4.5 结果与分析

4.6 小结

参考文献

致谢

作者简历