H1N1猪流感病毒与猪链球菌2型混合感染仔猪肺组织的基因表达谱分析

摘要

猪流感病毒(SIV)与猪链球菌2型(SS2)均为重要的呼吸道病原，两者混合感染所引起的猪呼吸道疾病综合征(PRDC)在临床中普遍存在，给养猪业造成了严重的经济损失。迄今为止，这两种病原的致病机制以及混合感染的协同致病机制仍不清楚，尚无有效的防治措施。本研究以仔猪为实验动物构建H1N1猪流感病毒与猪链球菌2型混合感染模型，利用基因芯片揭示单独感染与混合感染后仔猪肺组织的基因表达谱，并对差异表达基因进行分析，旨在探讨单独感染与混合感染在致病机制上的异同，为疫情的防制进行有益探索。
　　 1.仔猪H1N1猪流感病毒-猪链球菌2型混合感染模型建立
　　 在人工感染试验中，12头经检测SIV病原与抗体阴性、SS2抗体阴性仔猪随机分为4组，每组3头。实验第1天，SIV组和SIV-SS2组的仔猪鼻腔接种H1N1病毒液，同时空白对照组和SS2组使用DMEM进行相同处理。实验第4天，各组仔猪经2%冰醋酸溶液滴鼻处理30分钟后，SS2组和SIV-SS2组的仔猪鼻腔接种SS2细菌液，同时空白对照组和SIV组使用PBS进行相同处理。实验第6天，解剖各组仔猪观察脏器病变、采集样品(提取总RNA、分离鉴定病原、制作病理切片)。自实验开始，每天监测仔猪的体温、临床表现，隔天采集鼻拭子。研究结果显示：相对于单独感染，H1N1猪流感病毒与猪链球菌2型混合感染可引起更严重的体温紊乱、更多样的临床症状，范围更广、程度更深的剖检病变和组织病变；同时猪链球菌2型可能有助于H1N1猪流感病毒的增殖，使猪流感的感染症状持续更长的时间。
　　 2.仔猪H1N1猪流感病毒-猪链球菌2型混合感染基因表达谱分析
　　 利用从上述模型构建中采集的各组肺脏样品，抽提总RNA，经纯化、反转录、标记后与Agilent4×44K Porcine Oligo Microarray杂交。芯片原始数据经扣本底和归一化处理后，采用一维方差分析法(one way ANOVA)对组间差异进行统计学分析，以组间差异倍数(Fc)≥1.5，且q-value<0.05为标准筛选差异表达探针。结果显示：SIV组、SS2组、SIV-SS2组分别有1314、1354、2652个差异表达探针，对应444、411、844个差异表达基因。以Biological process为分类依据对各组差异表达基因进行Gene Ontology分析，结果显示SIV组、SS2组、SIV-SS2组的差异表达基因主要参与信号转导(signal transduction)、转录(transcription)、发育(development)、免疫应答(immune response)、细胞粘附(cell adhesion)、炎性反应(inflammatoryresponse)、凋亡(apoptosis)、天然免疫应答(innate immune response)等生物过程。以Kegg为数据库对各组差异表达基因进行pathway分析，结果显示SIV组、SS2组、SIV-SS2组的差异表达基因主要涉及细胞因子与细胞因子受体互作(Cytokine-cytokine receptor interaction)、Toll样受体途径(Toll-like receptor signalingpathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、凋亡(Apoptosis)、补体途径(Complement and coagulation cascades)、细胞粘附分子(Cell adhesionmolecules)、天然杀伤细胞介导的细胞毒作用(Natural killer cell mediatedcytotoxicity)、造血(Hematopoietic cell lineage)等信号通路。通过对比、分析SIV组、SS2组、SIV-SS2组的基因表达谱，推测H1N1猪流感病毒与猪链球菌2型混合感染的致病机制至少包括以下两点：(1)混合感染可刺激宿主产生大量细胞因子，造成炎性细胞浸润，引起炎性病理损伤；(2)混合感染可诱导宿主细胞大量凋亡，引起肺脏机能障碍。

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文摘

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缩略词表

1 前言

1.1 猪呼吸道疾病综合征(PRDC)

1.2 猪链球菌2型

1.3 H1N1型猪流感

1.4 基因芯片

1.5 研究目的及意义

2 材料与方法

2.1 毒株与菌种

2.2 实验动物

2.3 基因芯片

2.4 主要试剂及仪器

2.5 H1N1猪流感病毒检测

2.6 H1N1猪流感病毒与猪链球菌2型抗体检测

2.7 人工感染试验病原的制备

2.8 仔猪人工感染

2.9 样品采集

2.10 样品总RNA提取

2.11 芯片杂交

2.12 荧光定量PCR(qRT-PCR)

2.13 病理观察及细胞凋亡TUNEL检测

2.14 统计学分析

3 结果与分析

3.1 H1N1猪流感病毒与猪链球菌2型血清学调查

3.2 感染前后相关病原与抗体的检测

3.3 临床症状

3.4 剖检与病理变化

3.5 总RNA质量检测

3.6 芯片质检

3.7 差异表达基因的筛选

3.8 差异表达基因的分析

3.9 荧光定量PCR验证

3.10 细胞凋亡检测

4 讨论

4.1 混合感染的病原检测

4.2 临床症状与病理变化

4.3 SIV组差异表达基因

4.4 SS2组差异表达基因

4.5 SIV-SS2组差异表达基因

5 总结

参考文献

附录

致谢