PB转座子介导的双干扰载体及卵巢特异性表达载体的构建及其效果的研究

摘要

水牛是南方的重要品种资源，具有较强抗病抗逆耐粗的能力，而且水牛奶具有高蛋白高乳脂率的特征，将是南方鲜奶和高端奶的重要来源。我国政府大力支持在南方养殖奶水牛，然而水牛的繁殖性能较低，是水牛业发展的瓶颈问题。抑制素(Inhibin，INH)、卵泡抑素(Follistatin，FST)对促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，FSH)具有反馈调控作用，从而在一定程度上影响卵巢功能及卵泡发育。目前已开展了许多有关INH或FST单个基因免疫和提高动物繁殖力的研究，并取得了较好的效果：利用转基因和RNAi技术同时抑制INH和FST表达是否可以调控水牛卵巢功能和卵泡发育及提高繁殖性能，以及提高FSHp表达水平对生殖生理和繁殖性能的影响，这方面报道还不多。PiggyBac转座子(PB)是一种DNA转座子，已作为基因转移和插入诱变等基因研究的有效工具，广泛应用于哺乳动物基因功能和转基因的研究。本研究利用PB转座系统，构建了同时干扰INHA和FST的双干扰载体，在细胞水平分析表达和干扰效率、筛选稳定整合的阳性细胞；构建含有水牛卵巢特异性启动子的FSHβ表达载体，分析其特异表达特性和表达效率。为水牛基因功能、卵巢功能和卵泡发育调控机理及转基因技术打下基础。
　　 本研究的主要结果如下：
　　 (1)针对INHA和FST基因序列设计RNAi干扰片段，构建了含有两个转录元件的双干扰载体pB-H1-shRNA1-U6-shRNA2。
　　 (2)比较分析了双干扰载体的瞬时转染和与PB转座酶共转染的转染效率。分别利用瞬时转染和共转染方法转染水牛卵巢颗粒细胞(Buffalo fetal fibroblast cells，BuGCs)和水牛胎儿成纤维细胞(Buffalo fetal fibroblast cells，BuFFs)，分别统计转染第24h、48h和72h时载体中绿色荧光蛋白(GFP)在细胞中绿色荧光表达量。在转染24h时瞬时转染的细胞转染率高于共转染，而在其它时间共转染的转染效率均高于瞬时转染。
　　 (3)证明了双干扰载体pB-H1-shRNA1-U6-shRNA2对INHA和FST基因具有一定的抑制效果。通过Q-PCR检测，细胞内INHA和FST的mRNA的表达均因RNAi而有所减少，其中INHA在共转染BuGCs时被干扰程度最大(37.37%)，其表达量显著地低于空白对照组；在瞬时转染黄牛卵巢颗粒细胞(Bovine granulosa cells，BGCs)中FST干扰率为3.55%。
　　 (4)筛选出了INHA和FST基因RNAi片段稳定整合到基因组的阳性细胞。经G418筛选转染细胞，观察荧光表达情况，转染第7天后BuGCs和BuFFs荧光表达基本稳定，并且通过PCR鉴定转染后细胞基因组含有PB转座子的序列。
　　 (5)构建了分别含卵巢特异性启动子CYP19、OSP-1(广西大学惠赠)的pB-CYP19和pB-OSP1表达载体；
　　 (6)构建了水牛FSHβ全长cDNA的卵巢特异表达的pB-CYP19-FSHβ和pB-OSP1-FSHβ载体；
　　 (7)证明了两个表达载体具有卵巢特异表达的特性，pB-OSP1-FSHβ载体超表达效率较高。将两个载体分别转染BuGCs和BuFFs，利用RT-PCR技术检测出了BuGCs的FSHβ表达，而在BuFFs中却没有表达，证明了这两个载体具有水牛卵巢特异表达特性；而且pB-OSP1-FSHβ载体的FSHβ表达效率(13.04%)高于pB-CYP19-FSHβ载体(1.2%)，故pB-OSP1-FSHβ载体可用于水牛卵泡发育等繁殖调控的研究；同时也证明OSP-1是水牛卵巢特异表达的有效启动子。

目录

文摘

英文文摘

主要的仪器设备

缩略词表

第一部分 文献综述

第一章 转基因动物制备方法的研究进展

1.1 转基因技术研究概述

1.1.1 DNA显微注射法

1.1.2 逆转录病毒载体法

1.1.3 体细胞核移植法

1.1.4 胚胎干细胞介导法

1.1.5 精子载体法

1.2 生精细胞法介导基因转移研究进展

1.2.1 精子介导基因转移的基本原理

1.2.2 生精细胞法研究进展

第二章 牛的转基因研究现状

2.1 转基因牛的研究进展

2.2 RNAi技术在转基因牛的研究

2.3 转基因动物安全性及检测方法

2.4 研究目的和意义

第二部分 实验研究

实验一、睾丸注射慢病毒载体对公牛精液品质的影响

1.1 试验材料

1.1.1 实验牛群

1.1.2 慢病毒颗粒

1.1.3 主要仪器设备

1.2 试验方法

1.2.1 实验分组

1.2.2 公牛睾丸注射慢病毒

1.2.3 精液常规品质检查

1.3 结果

1.3.1 注射后对精液品质的影响

1.3.2 精子形态显微镜观察

1.4 讨论

试验二、血液、精液外源DNA扩增及血液生理生化指标的检测

1.1 试验材料

1.1.1 慢病毒颗粒

1.1.2 试验动物

1.1.3 主要酶、试剂及试剂盒

1.1.4 其他溶液的配制

1.1.5 主要仪器设备

1.2 试验方法

1.2.1 实验分组

1.2.2 公牛睾丸注射慢病毒

1.2.3 血样的采集与血常规检测

1.2.4 血液DNA的提取与检测

1.2.5 假阴道法人工采精

1.2.6 精液DNA的提取及检测

1.2.7 外源BSD基因的扩增

1.3 结果与分析

1.3.1 血常规检测指标结果

1.3.2 外源基因扩增结果

1.4 讨论

全文小结

参考文献

致谢