棉花纤维素生物合成复合体及相关蛋白功能研究

摘要

第一篇棉花纤维素生物合成复合体及相关蛋白功能研究
　　纤维素是世界上最丰富的碳水化合物和生物质资源，也是植物细胞壁的主要成分之一。纤维素由葡聚糖通过分子间氢键形成，葡聚糖则是通过葡萄糖β-1，4糖苷键聚合而成。纤维素由定位于膜上的纤维素合酶(Cellulosesynthase，CESA)复合体合成。虽然已经清楚复合体是由CESA组成，但对于复合体的结构和组成及其与纤维素合成的关系仍不完全清楚。对于复合体外影响纤维素合成的因子也不完全清楚。本研究利用棉花纤维原生质膜进行体外合成反应，用免疫共沉淀(Co-IP)分离棉花纤维中复合体并测定其合成纤维素活性，用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)鉴定复合体蛋白组成。另外，本研究克隆并表达了GhSGT1和GhSGT2。比较了它们在酶活、表达及热激反应方面的异同，期待在揭示SGT和纤维素合成关系方面提供线索和基础。主要研究结果如下:
　　1.添加纤维素酶有利于原生质膜合成结晶纤维素。Western-blotting显示有助于释放更多CESA。在提取棉花纤维细胞的原生质膜时添加适量的纤维素酶，有助于释放更多完整的纤维素合成复合体，提高体外合成结晶纤维素的产量。
　　2.用GhCESA1抗体免疫沉淀纤维素合成复合体，然后分别用GhCESA1、GhCESA2和GhSuSy抗体检测复合体蛋白，发现复合体中包含GhCESA1、GhCESA2和GhSuSy，这说明通过Co-IP可以沉淀到复合体组成蛋白。
　　3.用GhCESA1抗体免疫沉淀开花后24d棉纤原生质膜的裂解液，获得的纤维素合成复合体具有纤维素合酶活性，但是不能合成结晶纤维素。沉淀蛋白经过SDS-PAGE分离后取抗体带外的部分进行LC-MS鉴定，发现存8个CESA，经过与拟南芥CESA比对后，可将这8个CESA分为两种类型，即初生壁CESA和次生壁CESA。
　　4.GhSGT1和GhSGT2被克隆出来，其蛋白序列与其它物种SGT比对，可发现GhSGT均存在SGT特有的PSPD和PSPG保守序列。跨膜预测显示GhSGT2包含一个跨膜区段，而GhSGT1则无。GhSGT洋葱表皮亚细胞定位实验结果证实了预测结果。
　　5.纯化GST-GhSGT融合蛋白能以UDP-[U-14C]-glucose和β-谷甾醇或总甾醇为底物合成甾醇糖苷。
　　6.GhSGT1与GhSGT2在体外活性上存在很多差异。虽然用总甾醇作底物两个SGT掺入葡萄糖效率都增加，但GhSGT2增加更多，这说明膜上的某种物质能更有效提升GhSGT2活性。GhSGT2可以在较宽温度范围和更高温度条件下保持活性，GhSGT1则随着温度超过最适温度活性迅速衰退。Triton-100能显著提高GhSGT2活性而减少GhSGT1活性;β-巯基乙醇能显著提升GhSGT1活性对GhSGT2影响不明显。Mg2+和Na+对两个SGT活性有促进作用，但Mg2+对GhSGT2促进作用更明显，而Na+对GhSGT1活性促进作用更显著。动力学数据表明GhSGT2比GhSGT1有更高催化效率，对两种底物的亲和力更高。
　　7.Real-time分析结果表明，GhSGT随着棉纤发育表达量增加。GhSGT表达呈现一定组织特异性。在叶片和棉纤中，GhSGT2表达占优，而在根、茎及幼苗中，GhSGT1表达占优。它们表达对热激反应不同。GhSGT1在热激的前期表达升高后期下降，而GhSGT2在热激的后期表达升高。
　　第二篇棉花纤维KORRIGAN和木葡聚糖转移基因功能初探
　　棉花纤维作为重要的工业原料，其产量和品质对农业和工业的发展有重要的影响。海岛棉（Gossypiumbarbadense）和陆地棉（Gossypiumhirsutum）是棉花主要的两个栽培种，陆地棉产量高，品质中等，海岛棉品质好，产量低，因此，培育产量高、品质好的棉花品种一直是棉花品种选育的重要方向。棉纤维的发育可分为起始、伸长、次生壁增厚和脱水成熟4个时期，其发育过程与棉纤维的品质具有密切的关系，其棉纤维发育机理是棉纤维品质改良的基础。围绕着棉花纤维品质改良，本研究做了如下工作:(1)克隆两个可能与棉花纤维品质有关的木葡聚糖转移酶(XET/XTH)基因，对其棉纤中的表达做了分析，并将其构建到表达载体上。(2)克隆棉花KORRIGAN基因(AF511048)，分别构建到棉花超表达载体和RNAi载体上(3)将上述构建好的载体通过花粉管导入法转入棉花中。获得的主要结果如下:
　　1、在棉纤中克隆一个新的XET全长序列，该序列提交NCBI，Genbank号为JN968478;
　　2、半定量表达分析显示，JN968478在棉纤中的表达比另一个XET(AY189971)表达量高;
　　3、构建了棉花KORRIGAN的超表达载体和RNAi载体;
　　4、转基因苗的PCR鉴定
　　通过鉴定没有棉花转基因苗，可能转基因方法存在问题。

目录

声明

第一篇 棉花纤维素生物合成复合体及相关蛋白功能研究

摘要

缩略词表

1．文献综述

1．1 纤维素

1．2 纤维素合酶(Cellulose Synthase，CESA)

1．3 纤维素生物合成相关蛋白

1．4 本研究的目的和意义

2．材料与方法

2．1 材料

2．2 菌株和载体

2．3 方法

3．结果与分析

3．1 外源纤维素酶添加与体外纤维素合成

3．2 Co-IP分离鉴定

3．3 2D-PAGE和SDS-PAGE检测

3．4 LC-MS鉴定

3．5 棉花甾醇糖苷转移酶基因克隆和生物信息学分析

3．6 棉花甾醇糖苷转移酶活性分析

3．7 棉花甾醇糖苷转移酶表达分析及热激反应

4．讨论

4．1 纤维素合酶、纤维素合酶复合体和纤维素合成机理(Cellulose synthesis machinery)

4．2 甾醇、甾醇糖苷(SG)和甾醇糖苷转移酶(SGT)与纤维素合成

5．研究结论及工作展望

第二篇 棉花纤维KORRIGAN和木葡聚糖转移酶基因功能初探

摘要

1．文献综述

2．材料与方法

2．1 材料

2．2 菌株和载体

2．3 方法

3．结果与分析

3．1 GhXTH2／JN968478基因全长序列的获得

3．2 GhXTH／XET系统发生学分析

3．3 GhXTH表达分析

3．4 重组载体构建

3．5 转基因注射

4．讨论

参考文献

附录

附录1 常用试剂的配方

附录2 SGT编码序列和蛋白序列

附录3 引物序列

作者简介

攻读博士学位期间发表论文

致谢