鼠李糖乳杆菌LGG应用风险评估和益生元三丁酸甘油酯对斑马鱼益生效应评估

摘要

鼠李糖乳杆菌LGG（Lactobacillus rhamnosus）是上世纪八十年代由美国科学家从健康人肠道中分离出的一种乳酸菌，是目前全球研究最多的益生菌之一。LGG作为人源益生菌，能够有效改善消化道功能、提高机体免疫力，但其在水产养殖中的研究报道相对较少。因此本研究选择斑马鱼为研究对象，通过养殖及攻毒实验，评估了LGG对斑马鱼的益生效果及使用风险；为了进一步研究LGG的粘附性对其益生效果的影响，我们比较了LGG和其弱粘附型敲除株C11、D10对斑马鱼免疫保护效果的差异。相对于益生菌而言，益生元的稳定性和可操作性更高，因此更易在生产实践中推广使用。其中丁酸作为益生菌的重要代谢产物之一，同样具有改善肠道菌群结构、提高机体免疫力等功能。因此本研究选用了一种结构相对稳定的丁酸衍生物——三丁酸甘油酯（tributyrin）作为饲料添加剂，研究了其对斑马鱼的益生效果。以期为益生菌和益生元在水产养殖中的应用和益生机制研究提供一定的理论依据。
　　LGG益生作用评估实验结果表明：使用106 CFU/mL的LGG长期浸浴斑马鱼幼鱼，一定程度上能够促进幼鱼生长，但会降低幼鱼对嗜水气单胞菌NJ-1（Aeromonas hydrophila）的耐受性；进一步通过无菌斑马鱼模型研究发现，高浓度的LGG浸浴会明显降低斑马鱼的抗病性，而低浓度的LGG短期浸浴对宿主有一定的保护作用，且在攻毒后24 h时显著提高宿主相关免疫因子（IL-1β、TNF-α、saa、IL-10）的表达。此外本研究比较了LGG及其弱粘附型敲除株C11、D10的粘附能力差异，结果表明LGG为肠道壁定植型，敲除株为粘液定植型，敲除株定植能力显著下降。敲除株浸浴实验结果表明其可以有效的改变LGG带来的不利影响，提高宿主对嗜水气单胞菌的攻毒抵抗力，但敲除株是否能够有效消除LGG长期使用中的风险，仍有待进一步研究。
　　三丁酸甘油酯的益生作用评估实验表明：饲料中添加900 mg/kg的三丁酸甘油酯能够明显降低斑马鱼的增重率，显著提高其摄食耗氧和饥饿耗氧。通过检测攻毒后肠道碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）活发现，三丁酸甘油酯对斑马鱼没有免疫保护作用；但肠道超氧化物歧化酶酶活显著升高，热应激蛋白 hsp70及肠道相关炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-10）的基因表达显著下调，TGFβ的表达略有下调，但未出现统计学差异。综上结果表明三丁酸甘油酯不是由于引起斑马鱼应激或炎症反应而造成的“减肥”效应。为了进一步阐述三丁酸甘油酯抑制斑马鱼体增重的机制，我们检测了肝脏乙酰辅酶a羧化酶（ACC1）及相关消化酶的基因表达情况，结果表明三丁酸甘油酯处理后，斑马鱼肝脏ACC1、lpl和lipc基因表达水平均被显著下调。三丁酸甘油酯抑制斑马鱼体增重的机制还有待进一步研究。
　　综上所述，本研究发现长时间或高浓度的LGG浸浴斑马鱼幼鱼均会降其抵抗力；LGG较强的粘附性可能是其降低幼鱼抵抗力的主要因素；益生元三丁酸甘油酯对斑马鱼的生长有一定的抑制作用；三丁酸甘油酯能够影响斑马鱼脂代谢过程中相关基因的表达。本研究为益生菌及益生元的在水产养殖中的应用及益生机制研究提供了一定的理论依据。

目录

声明

缩略语表

第一章 文献综述

1 益生菌在水产养殖中的应用

1.1 水产养殖现状

1.2 益生菌

1.3 益生菌在水产养殖业中的应用

2 益生菌的作用机制

2.1 竞争性排除

2.2 提高免疫力

2.3 产生有益代谢产物

3 益生元

4 研究目的与意义

第二章 LGG对斑马鱼的益生作用及风险评估

1 前言

2 材料和方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 LGG长期浸浴对斑马鱼幼鱼生长的影响

3.2 LGG长期浸浴对斑马鱼存活率的影响

3.3 LGG短期浸浴对无菌斑马鱼抵抗力的影响

3.4 LGG对炎症因子的影响

3.5 LGG及其敲除株C11、D10的粘附差异

3.6 粘附能力对LGG使用风险的影响

4 讨论

第三章 三丁酸甘油酯对斑马鱼益生作用评估

1 前言

2 材料和方法

2.1 材料

2.2 试验方法

3 结果与分析

3.1 生长相关结果及分析

3.2 消化酶活性及基因表达

3.3 IAP、SOD活性及肠道免疫细胞因子、hsp70表达

3.4 短期呼吸仪试验结果

3.5 肝脏相关基因表达

4 讨论

4.1 TB与肥胖

4.2 TB对免疫力的影响

4.3 TB影响脂代谢

参考文献

致谢