马铃薯晚疫病抗性资源筛选及其抗病基因组成鉴定

摘要

晚疫病(Late blight)作为全球范围内马铃薯生产上的头号病害，每年因晚疫病所造成的直接经济损失高达马铃薯总产值的15％。大量化学杀菌剂不仅增加资金投入，还会严重污染环境甚至危害人体健康，故防治晚疫病最为经济有效的方法是育成具有广谱且持久晚疫病抗性的品种。我国马铃薯晚疫病抗病育种中遇到的最大困难是抗性资源缺乏，现存的少数抗性资源的遗传背景、抗性来源不清楚，严重制约抗病育种。聚合马铃薯中具有NBS-LRR结构域的R基因育种仍是目前国内外最有成效的马铃薯抗晚疫病育种方法。
　　本研究基于本实验室十多年晚疫病抗病资源研究基础，旨在通过筛选得到一批马铃薯晚疫病抗性材料，并利用植病互作机制，R基因诊断标记，效应子组学和dRenSeq相结合的策略，明确优异抗性材料中已知R组成，并探索材料中是否含有未知抗病基因。为聚合抗病基因，选育广谱且持久的马铃薯品种提供资源基础;为克隆未知R基因提供原始材料和技术支持。主要结果如下:
　　1.用16-2、3928A、14-2三个晚疫病强毒力小种接种鉴定收集自国内外的240余份马铃薯材料，最终筛选出抗性水平在中抗及以上的抗性材料为36份。使用采自云南GN51，武汉HTP-9，荷兰NL11564的三个晚疫病原菌接种36份抗性材料，了解材料抗病谱。绝大多数材料对GN51依旧保持较好的抗性;新采集的HTP-9菌株能克服14％的抗性材料;50％的抗性材料能被NL11564克服。
　　2.R8基因PCR分子诊断结果表明:包含抗性对照材料‘加湘1号’共有20个抗性材料含有R8基因，说明R8基因在抗性材料中出现频率高。从7个晚疫病原菌生理小种中都能扩增出Avr8基因，尽管存在少数碱基差异，但都能与R8识别，推测这是R8具有广谱抗性的原因之一。抗性鉴定结果表明含有R8基因的材料大多数能病原小种NL11564克服。
　　3.选取了24个经过晚疫病抗性鉴定的具有一定代表性的马铃薯材料，进行了抗病基因测序诊断(dRenseq)，序列比对分析明确:这些材料中主要含有8个R基因，其中6个晚疫病抗性基因，分别是R8，R3a，R3b，R1，Rpi-blb1和Rpi-ptal，还有与病毒抗性相关的Rx，及抗线虫相关基因Gpa2。其中高代系抗晚疫病育种亲本06HE13-1含抗病基因多达6个。
　　4.根据诊断结果从抗性材料06HE13-1中尝试扩增R1和R8基因，克隆的R1和R8都存在长短两种类型，符合预期长度的基因分别能与Avr1和Avr8识别，表明这个材料中含有R1和R8基因，证明了dRenseq诊断结果的准确性。
　　5.利用PVX-agroinfection技术，在抗性材料叶片上用农杆菌进行牙签穿刺瞬时表达38个效应子。12个材料在单次穿刺表达效应子实验中有半数以上的穿刺点出现坏死斑，16个材料在穿刺实验中有少数效应子穿刺点出现坏死斑，表明抗性材料中可能存在与效应子识别的未知R基因。但仍然需要更多重复来验证。
　　6.36份抗性材料进行倍性鉴定结果显示:这些材料包含6个二倍体，21个四倍体，1个五倍体，和4个六倍体;农艺性状调查显示，材料总体农艺性状较好，并且具有一定多样性。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 马铃薯概述

1．2 马铃薯晚疫病

1．2．1 病原菌的侵染循环及快速进化

1．2．2 马铃薯晚疫病的危害及防治措施

1．2．3 马铃薯抗病育种相关种质资源

1．3 马铃薯晚疫病抗病基因研究进展

1．3．1 已克隆的晚疫病抗病R基因

1．3．2 晚疫病抗病基因的应用

1．3．3 植病互作功能基因组学与效应子组学研究

1．3．4 dRenseq技术与效应子组学结合加速R基因的克隆

1．4 课题提出、目的与意义

2 材料方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 供试载体及菌株

2．1．3 实验试剂

2．1．4 晚疫病原菌

2．2 实验方法

2．2．1 晚疫病原菌分离、培养及离体叶片接种鉴定

2．2．2 载体构建

2．2．3 dRenseq

2．2．4 农杆菌瞬时表达

2．2．5 倍性测定及相关农艺性状调查

3 结果分析

3．1 强毒力晚疫病小种初步鉴定马铃薯材料抗性

3．2 多个病原小种对初筛抗性材料的抗性鉴定

3．2．1 晚疫病原菌3928A接种评价抗性

3．2．2 其他强毒力晚疫病原菌小种接种评价抗性材料

3．2．3 PCR扩增检测抗性材料中是否存在R8基因

3．2．4 R8基因具有较为持久抗性原因的探究

3．3 dRenseq技术诊断抗性材料中R基因组成

3．3．1 dRenseq技术诊断抗性材料中已知R基因组成

3．3．2 dRenseq诊断结果进一步确认

3．4 基于PVX载体农杆菌瞬时表达体系探索未知R基因

3．5 抗性材料农艺性状调查及倍性鉴定

3．5．1 抗性材料的倍性

3．5．2 抗性材料农艺性状

4 讨论

4．1 材料的多样性及晚疫病抗病基因的组成

4．2 R8基因在抗性材料中高频出现

4．4 dRenSeq高通量诊断R基因组成的准确性

4．5 展望

参考文献

附录

致谢