披针新月蕨和华南毛蕨的化学成分及生物活性研究

摘要

本论文主要对两种民间药用蕨类植物披针新月蕨和华南毛蕨的生物活性及化学成分进行了系统研究，主要内容分为三部分：第一部分研究了披针新月蕨总黄烷及其酸水解物的制备工艺和高效液相色谱-质谱联用化学成分分析，同时评价其总黄烷及酸水解物对丙酸睾酮诱导的去势雄性大鼠的良性前列腺腺增生模型的治疗活性，并探讨了其潜在的作用机制；第二部分采用活性跟踪分离手段对披针新月蕨中具有神经保护活性的成分进行了研究，并测试了分离所得化合物对多巴胺诱导的PC12细胞氧化损伤模型和对D-半乳糖长期给药导致的老年痴呆小鼠模型的药理活性，并研究其作用机制；第三部分主要对华南毛蕨叶的化学成分进行了研究，并利用多种肿瘤细胞系对分离所得查尔酮类化合物进行了抗肿瘤活性测试。
　　第一部分：披针新月蕨抗良性前列腺增生活性研究
　　目的：建立利用大孔树脂技术富集纯化披针新月蕨总黄烷(TFA)的制备工艺；利用HPLC-MS/MS技术分析总黄烷及其酸水解物的主要化学成分；评价披针新月蕨总黄烷及其酸水解物(AHT)对丙酸睾酮诱导的去势雄性大鼠的良性前列腺腺增生模型的治疗作用，并阐明其作用机制。
　　方法：通过静态吸附、解吸附试验筛选最佳型号树脂，采用动态吸附、解吸附试验和正交试验优化工艺参数，进行UV含量测定和HPLC分析富集效果；利用HPLC-DAD-MS/MS成分分析技术和标准品共进样分析总黄烷及其酸水解物的主要化学成分；通过丙酸睾酮诱导的去势雄性大鼠的良性前列腺腺增生模型评价其抗良性前列腺增生活性，通过前列腺指数及生长因子测定、HE染色、免疫组化法检测VEGF在前列腺组织中的表达和分布，通过Western Blot法检测Bax、Bcl-2和p53蛋白在大鼠前列腺组织中的表达。
　　结果：成功建立了大孔树脂富集纯化披针新月蕨总黄烷的制备工艺，样品经大孔树脂处理后黄酮含量由21.85％增加至63.12%，HPLC分析亦表明样品经大孔树脂处理后黄烷-4-醇苷类成分含量明显增加；通过高效液相色谱-质谱联用技术从TFA中鉴定识别了15个化合物，其中包括12个黄烷-4-醇苷类化合物，从AHT中鉴定识别了一个花青素类主要成分，即7-hydroxy-4'-methoxy-6,8-dimethylanthocyanidin；大鼠的药理实验结果表明TFA和AHT均具有显著的抗前列腺增生活性，并证明其能有效降低前列腺中双氢睾酮和生长因子水平，同时通过上调促细胞凋亡蛋白（p53，Bax）水平，减弱抑细胞凋亡蛋白（Bcl-2）的表达发挥其药理作用。
　　结论：披针新月蕨总黄烷及酸水解物具有作为治疗良性前列腺增生治疗药物的潜力，其作用机制包括影响前列腺组织中双氢睾酮和生长因子的水平，以及调控前列腺组织细胞凋亡蛋白的表达。
　　第二部分：披针新月蕨抗老年痴呆活性成分及作用机制研究
　　目的：寻找披针新月蕨中具有抗老年痴呆作用的活性化合物；探讨化合物TMF的体内外抗老年痴呆活性，并对其相关作用机制进行研究。
　　方法：利用体外抗氧化模型和多巴胺诱导的PC12细胞氧化损伤模型筛选披针新月蕨中具有神经保护作用的活性部位；通过活性跟踪分离方法，采用多种色谱分离技术对活性部位进行化学成分分离，并通过多种波谱解析手段对所得化合物进行结构鉴定；通过多巴胺诱导的PC12细胞氧化损伤模型和D-半乳糖小鼠模型评价化合物TMF的抗老年痴呆活性，并进行MTT测试、Hoechst33258、Rodanmine123和DCFH-DA等荧光探针染色试验、GSH/GSSG比例测定、Morris水迷宫试验、ELISA试剂盒测定海马内AP-1和BDNF水平、Western Blot法检测海马内CREB表达水平。
　　结果：披针新月蕨提取物中低极性部位FD为其具有神经保护作用的活性部位；从FD中分离得到三个化合物，其中5,2',5'-trihydroxy-7-methoxyflavone为新化合物，(2S)-5,2',5'-trihydroxy-7-methoxyflavanone(TMF)为新的天然产物；MTT测试发现化合物TMF对多巴胺诱导的PC12细胞具有显著的保护作用，而且荧光染料染色实验和GSH/GSSG测定均表明其能明显改善细胞内的氧化失衡状况；Morris水迷宫试验表明TMF能显著改善D-半乳糖小鼠的认知障碍和长期记忆能力，ELISA测试证明TMF能降低海马内AP-1水平，并使BDNF水平升高，Western Blot试验表明TMF能上调海马内磷酸化CREB的表达水平。
　　结论：TMF具有良好的体外和体内抗老年痴呆活性，其可能的作用机制为 TMF通过缓解细胞及海马内氧化失衡状况，并调控海马内BDNF和CREB的表达。
　　第三部分：华南毛蕨的化学成分及生物活性研究
　　目的：研究华南毛蕨叶的化学成分，并从中寻找具有抗肿瘤活性的化合物。
　　方法：采用多种柱色谱技术对华南毛蕨叶二氯甲烷提取物进行分离纯化，利用核磁共振谱等多种波谱数据鉴定化合物结构；采用SRB(Sulforhodamin B)法对分离所得查尔酮类化合物进行六种人源肿瘤细胞系（肺癌A549细胞、肝癌HepG2细胞、乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞、白血病ALL-SIL细胞和胰腺癌SW1990细胞）的抗肿瘤活性筛选，并利用流式细胞仪和克隆形成实验对活性化合物的抗肿瘤作用进行了初步研究。
　　结果：从华南毛蕨叶的二氯甲烷提取物中分离得到18个化合物（其中包括8个查尔酮类化合物1-8）： parasiticin A(1)，parasiticin B(2)，parasiticin C(3),5,7-dihydroxy-4-phenyl-8-(3-phenyl-trans-acryloyl)-3,4-dihydro-1-benzopyran-2-one(4)，interruptin B(5),2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcone(6),2′-hydroxy-4′,6′-dimethoxychalcone(7),2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′-methylchalcone(8),5,7-dihydroxy-6,8-dimethylflavaone(9),5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone(10)，loliolide(11)，phytol(12)，lutein(13),δ-tocopherol(14)，sargaol(15),9Z,12Z-octadecadienoic acid(16),1,2,3-trilinolein(17)，andβ-sitosterol(18),其中1-3为新化合物；抗肿瘤筛选试验表明化合物3和6具有明显的抗肿瘤细胞增殖活性，且对六种肿瘤细胞系均有抑制生长效应，化合物3和6对HepG2细胞的增殖抑制作用最为强烈，IC50分别仅为1.64μM和2.82μM；流式细胞仪检测表明化合物3和6能够以浓度依赖的方式对HepG2细胞诱导产生凋亡效应；而且克隆形成试验结果表明化合物3能有效抑制细胞克隆的形成。
　　结论：华南毛蕨中富含查尔酮类化合物，且分离所得化合物3和6具有明显的抗肿瘤活性。

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前言

参考文献

第一章 披针新月蕨抗良性前列腺增生活性研究

第一节 大孔树脂富集纯化披针新月蕨总黄烷苷的工艺研究

第二节 披针新月蕨总黄烷苷及其酸水解物的制备与HPLC-MS/MS分析

第三节 披针新月蕨总黄烷苷及其酸水解物抗良性前列腺增生的活性研究

参考文献

第二章 披针新月蕨抗老年痴呆活性成分及作用机制研究

第一节 披针新月蕨不同极性部位的制备及活性部位的筛选

第二节 FD部位的成分分离与化合物的结构解析

第三节 化合物TMF的抗老年痴呆药理活性研究

参考文献

第三章 华南毛蕨的化学成分及生物活性研究

第一节 华南毛蕨叶的化学成分研究

第二节 华南毛蕨查尔酮类化合物的抗肿瘤活性研究

参考文献

第四章 植物制剂治疗前列腺增生症的研究进展

参考文献

个人简介

攻读学位期间发表论文及专利目录

致谢

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