表面涂层纳米掺锶羟基磷灰石的天然煅烧骨三维多孔材料的制备及成骨活性研究

摘要

第一部分掺锶羟基磷灰石（SrHA）涂层煅烧骨（TBC）的制备及理化性质的研究
　　目的：探讨TBC表面涂层SrHA的制备方法，并评价其理化性质。
　　方法：首先通过两次高温煅烧天然牛松质骨获得基质材料TBC，将其锯成1.5×1cm的立方体，反复无水乙醇、纯水清洗，干燥备用。根据溶胶-凝胶法（sol-gel）原理，将不同浓度Ca(NO3)2·4H2O和Sr(NO3)2溶于去离子水中获得前驱液，设置溶液中Sr/Sr+Ca为0,10%，40%,100%四组不同的比例，在不同的前驱液中分别滴入(NH4)2·HPO4溶液，同时保证反应体系中Ca+Sr/P为5/3，室温超声搅拌，适当加入NH4OH溶液调节反应体系中PH为10，待形成溶胶时，将备好的TBC分别缓慢浸入上述溶液体系中，充分反应后取出，干燥，700℃下再次煅烧，重复上述过程三次使其在TBC表面完全反应，获得不同浓度SrHA涂层的TBC支架，分别称为nTBC，Sr10-TBC，Sr40-TBC，Sr100-TBC。对获得的不同支架通过能谱扫描电镜（SEM）、X射线衍射（XRD）及X射线荧光光谱分析（XRF）进行表征，同时通检测各组支架的孔隙率及力学强度，与TBC进行比较观察。
　　结果：经过sol-gel反应体系后，低倍镜下TBC的三维天然松质骨结构无明显改变，各组支架的孔径大小基本相同（200-850um），但高倍镜下可见反应后的TBC表面均匀分布微纳米结构的SrHA磷灰石涂层，随着涂层中Sr含量的增高，沉积的磷灰石晶体维度逐渐变长，密度逐渐稀疏，形状从短棒状变为类球形最终变为长针状。XRD显示随着Sr含量的上升，出现波峰的升高及偏移，但各组反应体系均表现为单一的羟基磷灰石物相。XRF显示各组反应体系中磷灰石涂层的Sr含量接近但略低于理论值，Ca+Sr/P接近理论值1.67。各组支架的孔隙率及力学强度与TBC相比未见明显差异。
　　结论：本实验成功制备 SrHA涂层的TBC支架，并且当反应体系中Sr浓度较低时（nTBC及Sr10-TBC组），TBC表面的磷灰石涂层为分布较均匀的纳米结构，Sr含量为40%及100%时表面形貌则达到微米级别，相比于单纯的TBC，较低浓度的SrHA沉积可获得更为理想的表面纳米形貌，而不影响其三维多孔结构及生物力学性能。
　　第二部分 SrHA涂层的TBC活性支架对MC3T3-E1细胞粘附、增殖及成骨分化影响的实验研究
　　目的：通过比较各组材料对MC3T3-E1细胞粘附、增殖及成骨分化的作用，筛选出适宜成骨微环境的涂层煅烧骨材料。
　　方法：将 MC3T3-E1细胞以5×104 cells mL?1的密度种植于 TBC, nTBC, Sr10-TBC, Sr40-TBC及Sr100-TBC各支架（规格10 mm×2 mm）上，待充分贴壁后每两天换液一次，到达规定检测时间点对细胞进行钙黄绿素/碘化丙啶染色，通过共聚焦显微镜观察细胞在种植后4小时、1天及7天在支架上的粘附、细胞相容性等情况，通过间接计数法检测细胞在各支架上的粘附率。在种植后的1、3、7天通过MTT法评价细胞在各支架上的增殖能力；通过评价各组碱性磷酸酶(ALP)活性、反转录PCR技术检测成骨基因Runx2及成骨相关蛋白骨桥蛋白（OPN)、骨钙素（OCN）的表达水平来评价 MC3T3-E1细胞在不同材料上的成骨分化活性。
　　结果：种植4h后相比TBC支架，nTBC及Sr10-TBC组均能显著提升MC3T3-E1的细胞粘附率(P<0.01)， Sr40-TBC组也表现出更高的粘附能力(P<0.05)，而Sr100-TBC组与TBC组未见明显差异；种植后1天，通过共聚焦显微镜观察，TBC及Sr100-TBC组MC3T3细胞大多数分布于支架小梁的边缘，细胞数量少，而nTBC、Sr10-TBC及Sr40-TBC组可见细胞均匀分布于小梁的表面，细胞数量相对较多；7天后，各组支架单位面积细胞数量均增多，其中nTBC、Sr10-TBC及Sr40-TBC组显著多于TBC及Sr100-TBC组，以Sr10-TBC组最为显著，可见大面积相互汇聚的细胞覆盖于材料表面，另外Sr40-TBC及Sr100-TBC组可见较多红染的死细胞存在；增殖分化结果显示相比单纯的TBC，表面涂层的TBC支架能明显促进成骨增殖分化，以Sr10-TBC组最为显著表现出最强成骨增殖分化活性，然而随着Sr含量的进一步提升，相比nTBC组，Sr40-TBC及Sr100-TBC组表现出降低的成骨增殖及升高的成骨分化活性。
　　结论： TBC表面沉积合适的SrHA涂层能显著促进MC3T3的粘附、增殖及分化，其作用同时取决于涂层的表面微观形貌和释放的Sr元素含量，相比其他各组Sr10-TBC表现出最高成骨增殖、分化活性，提示10%SrHA涂层是促进成骨增殖、分化的相对最适浓度。
　　第三部分 SrHA涂层的TBC活性生物材料修复兔桡骨缺损模型的实验研究
　　目的：进一步评价筛选出的Sr10-TBC支架修复兔桡骨临界缺损的能力，研究其应用于骨缺损修复的疗效及可行性。
　　方法：取六个月龄新西兰大白兔24只，体重2.5±0.4 kg，每只分别造双侧桡骨中段1.5cm临界性骨缺损，将消毒好的TBC及Sr10-TBC支架分别植入两侧作自身对照，分别于4W及12W处死取材，通过三维CT影像学及组织学检测评价骨缺损修复情况。
　　结果：影像学检测显示：4W时Sr10-TBC组断端与材料之间界限不清，材料周围可见大量骨痂形成；TBC组材料断端之间界限清楚，未见明显骨痂形成；12W时Sr10-TBC组材料与宿主骨完全整合，断端之间可见连续性骨痂形成；TBC组断端材料界限模糊，材料尚未与宿主骨完全整合；不同时间Sr10-TBC组影像学评分均显著高于TBC组（P<0.05)。组织学切片显示：1、纵切面：4W时Sr10-TBC组植体周围新生骨痂显著多于TBC组；12W时Sr10-TBC组周围骨痂整合大量新生骨向材料内部渗透生长，新生骨与材料之间无明显界限，TBC组材料周围可见大量桥梁新生骨，新骨与材料之间存在明显纤维结缔组织界限，未见明显新生骨长入材料内部；2、横切面显示4W，12W不同材料缺损中心区新生骨量Sr10-TBC组均多于TBC组，12周时Sr10-TBC组材料结构失常，可见部分降解，TBC组未见明显材料降解。通过组织计量学定量评价各组新生骨量bone area ratio（BAR)及材料剩余量residual material area（RMA)，结果显示不同时间点Sr10-TBC组BAR均显著高于TBC组，材料残存量4W时两者无明显差异，12W时Sr10-TBC组RMA显著低于TBC组（P<0.05)。
　　结论： TBC表面涂层10%SrHA能显著提高其作为植入物促进体内骨缺损修复的能力并改善材料的降解能力，这种天然多孔的生物活性材料可以为骨组织工程领域提供一种新的选择，值得进一步研究。

目录

声明

英文缩略词表（Abbreviations）

前言

参考文献

第一部分 掺锶羟基磷灰石（SrHA）涂层煅烧骨（TBC）的制备及理化性质的研究

引言

实验材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 SrHA涂层的TBC活性支架对MC3T3-E1 细胞粘附、增殖及成骨分化影响的实验研究

引言

实验材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 SrHA涂层的TBC活性生物材料修复兔桡骨缺损模型的实验研究

引言

实验材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文小结

综述：羟基磷灰石的掺杂改性及其在骨组织工程中的应用

附录 攻读硕士学位期间发表的文章

致谢