鸢尾苷元在对乙酰氨基酚致肝损伤中的保护作用研究

摘要

对乙酰氨基酚（APAP）是一种应用广泛的解热镇痛消炎药，过量 APAP能引起急性肝损伤。目前，临床上仅有 N-乙酰半胱氨酸（NAC）一种上市药物用于治疗 APAP导致的肝损伤。研究表明，具有抗氧化抗炎作用的天然化合物，如咖啡酸、白藜芦醇、商陆皂苷甲、黄酮类化合物异槲皮素及水飞蓟素等，可用于缓解 APAP肝毒性。鸢尾苷元（TG）为具有抗炎、抗氧化活性的二氢异黄酮，其对过氧化氢、四氯化碳及叔丁基过氧化物诱导的肝细胞损伤均具有保护作用。但是，国内外尚未见关于TG保护APAP诱导的肝损伤相关研究。本文拟建立APAP致小鼠肝损伤模型，考察TG预处理七天及后处理对APAP致肝损伤的影响，并研究其可能的保护机制。
　　本文首先分别考察了不同剂量APAP（200 mg/kg、400 mg/kg及600 mg/kg）、造模前禁食与不禁食对小鼠肝损伤的影响。造模后的血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平检测结果表明：非禁食状态下ALT及AST水平随着APAP剂量增加而升高，即肝损伤呈剂量依赖性；相同APAP剂量下，禁食组ALT及AST值均比未禁食组高，即造模前禁食可使小鼠对APAP肝损伤更敏感。因此，本文确定小鼠隔夜禁食后腹腔注射给予300 mg/kg APAP进行肝损伤模型造模。
　　由于TG水溶性差，故而造模条件还包括考察常用溶剂或助溶剂对APAP肝损伤模型的影响。常用注射媒介包括DMSO、乙醇、吐温80、丙二醇（PG）及Kolliphor?HS15等。其中，DMSO及乙醇均具有抑制CYP2E1酶作用从而缓解APAP肝损伤，吐温80具溶血性，上述三种溶剂均不适宜作为APAP模型中的溶媒。因此，本文从血清转氨酶水平、肝脏还原性谷胱甘肽（GSH）含量、肝脏切片病理生理学、肝组织中CYP2E1蛋白含量及体外PG与HS15分别对小鼠肝微粒体CYP2E1酶的抑制作用等方面考察PG与HS15分别预处理七天对APAP诱导肝损伤模型的影响。结果表明，HS15对APAP诱导肝损伤模型无明显影响，而PG显示出明显的保护作用。蛋白免疫印迹及酶抑制实验结果显示，PG可能通过抑制CYP2E1而达到减弱肝损伤的效果。因此，本文选择用10% HS15作为TG的溶媒。
　　本文分别考察造模前 TG预处理七天及造模后处理对 APAP致肝损伤的影响。于造模后不同时间点（2 h、6 h及24 h）测定血清转氨酶、肝脏氧化应激有关生化指标（如GSH含量、超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量、ROS水平及过氧化氢酶活性）及肝组织病理生理学。模型组血清转氨酶水平随着时间增加而升高。试验组血清转氨酶结果与肝组织H&E染色结果一致，表明在TG预处理及后处理情况下均有肝保护作用。肝脏生化指标表明，造模前TG预处理可能降低APAP早期损伤引起的氧化应激；但TG后处理后各组肝脏生化指标无明显变化趋势。
　　本文进一步测定TG抑制小鼠肝微粒体CYP2E1酶IC50值，并采用蛋白免疫印迹及实时荧光定量PCR技术，考察APAP损伤有关蛋白及基因表达变化情况，从而探讨TG预处理及后处理情况下的肝保护机制。研究结果显示，TG抑制小鼠肝微粒体CYP2E1的IC50值为196.6μM，即TG对CYP2E1基本无抑制作用。蛋白免疫印迹结果表明，与正常组相比，APAP诱导的肝损伤会导致造模后24 h肝脏 MRP2的蛋白表达量上调，CYP2E1蛋白表达量下调，细胞增殖相关蛋白P21的蛋白表达量下调。TG预处理及后处理均不会改变APAP损伤下的CYP2E1蛋白表达量，但均会使MRP2及P21蛋白表达量上调。RT-PCR结果表明，与对照组相比，APAP造模后24 h会使APAP代谢即转运有关的I相代谢酶及转运体基因表达水平下调，并且可能影响 p53/p21通路及 Nrf2/Keap1通路相关基因。TG预处理及后处理均会上调Nrf2通路的Ho-1基因，其主要与抗氧化作用有关。TG预处理对细胞增殖功能相关的p21基因影响不明显但能显著调控P21蛋白含量，而TG后处理能影响p21基因水平并对其蛋白具有调控趋势，且与阳性对照NAC组结果一致，表明TG的肝保护作用可能与细胞再生功能有关。
　　综上，TG预处理七天及后处理均能保护APAP诱导的肝损伤。TG对APAP主要代谢酶CYP2E1无明显抑制作用，且不影响GSH水平的变化，而可能是通过调控与APAP II相代谢结合物有关的转运体MRP2，抗氧化作用相关蛋白Ho-1及肝再生相关蛋白P21的蛋白及基因表达量而减少肝损伤。

目录

声明

缩略词

前言

1.立题依据及意义

2.研究目的

3.研究内容

第一章 对乙酰氨基酚小鼠肝损伤模型的建立

1 试验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

5本章小结

第二章 鸢尾苷元对小鼠APAP肝损伤的保护作用

1仪器与材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

5本章小结

第三章 鸢尾苷元对APAP肝损伤的保护机制

1仪器与材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

5本章小结

结论和展望

1全文总结

2创新性

3展望

参考文献

综述:对乙酰氨基酚致急性肝损伤的机制及干预靶点研究进展

致谢

附录