增加了Cys残基的小麦1Ax1亚基人工突变体的品质功能研究

摘要

小麦种子储藏蛋白特性决定着小麦终用途品质。其中，高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)通过分子间二硫键与低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)交联形成的麦谷蛋白聚合体是小麦面团品质特性的重要决定因子。而HMW-GSs1Dx5+1Dy10被普遍认为是小麦麦谷蛋白优质亚基组合，其中1Dx5亚基所特有的中间重复区额外Cys残基推测对于了解面团粘弹性的形成具有十分重要的意义。到目前为止，关于该Cys残基在小麦面粉功能特性中的作用仍不清楚。
　　本文通过人工定点突变，将1Ax1亚基基因中与1Dx5亚基额外Cys密码子位置相对应的Ser密码子替换为 Cys密码子，构建了重组质粒 pLRPT-Glu-Mut1Ax1和pLRPT-Glu-WT1Ax1；通过基因枪转化法将 mut1Ax1/wt1Ax1基因分别转入到普通小麦品种L88-31中；经PCR、Southern blot、RT-PCR和SDS-PAGE技术确证获得了独立的转基因植株。经过连续五代(T0-T4)的筛选，共获得了4个(mut1Ax1)和1个(wt1Ax1)的转基因纯合株系。采用光密度分析、面筋仪2200、揉混仪、排阻高效液相色谱(SE-HPLC)、马尔文激光粒度仪、电子扫描显微镜(SEM)、傅立叶红外光谱(FTIR)等技术手段，研究外源Mut1Ax1/WT1Ax1亚基对面团揉混特性、麦谷蛋白大聚合体(GMP)分子量分布、面筋网络结构及二级构象变化、以及二硫键(SS)含量的影响。从而，为更好地了解含有该额外 Cys残基的突变亚基对面粉揉混特性及面筋蛋白理化特性的影响以及相关作用机理提供理论依据。本研究主要结果如下：
　　(1)光密度分析结果显示外源基因mut1Ax1与wt1Ax1的表达水平相似；面筋指数和面粉揉混分析结果显示与WT1Ax1亚基相比，Mut1Ax1亚基能显著地提高面筋含量，增强面筋强度和面团抗拉伸特性，表明含有额外Cys残基的Mut1Ax1亚基对面筋强度有正向效应。
　　(2) SE-HPLC、粒度分析、SEM分析结果显示Mut1Ax1较WT1Ax1能显著增加大分子蛋白聚合体含量及GMP颗粒平均粒径，表明前者有利于增强面筋蛋白聚合度及面筋网络的充分形成。
　　(3)转mut1Ax1基因株系面筋样品中SS含量较转wt1Ax1基因株系(WT1Ax1-1)显著增加，表明Mut1Ax1中额外Cys残基参与了分子间二硫键的形成，进而加强了麦谷蛋白亚基分子间的相互作用。而其面筋蛋白二级构象random coil及β-turn向β-sheet的明显转换表明Mut1Ax1亚基更有利于面筋蛋白的有序折叠聚合。Mut1Ax1对面团加工品质特性的影响应归因于其中间重复区额外Cys残基参与形成分子间二硫键，增强亚基间交联度，有利于GMP聚合以形成更为致密的面筋网络，进而牢牢包埋淀粉及其它非可溶性颗粒，加强了面粉多组分间的充分互作，从而改善了面团品质。

目录

声明

1 绪 论

1.1 小麦概述

1.2 小麦加工品质

1.3 小麦面筋蛋白研究

1.4 面筋蛋白理化特性变化机理的相关研究

1.5 本研究的目的和意义

2 小麦mut1Ax1和wt1Ax1基因载体构建及遗传转化

2.1 实验材料、仪器及试剂

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 小结

3 小麦Mut1Ax1亚基对面粉品质特征参数的影响

3.1 实验材料、仪器及试剂

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 小结

4 小麦Mut1Ax1亚基对面筋蛋白理化特性的影响

4.1 实验材料、仪器及试剂

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

4.5 小结

5 全文总结与主要创新点

5.1 讨论

5.2 总结

5.3 主要创新点

5.4 课题展望

致谢

参考文献

附录1 攻读学位期间发表的论文

附录2 主要缩略词表

附录3 培养基母液配方

附录4 阳性克隆测序结果