合成共轭亚油酸益生菌的筛选及其免疫调节功能研究

摘要

Cis-9,trans-11共轭亚油酸(c9,t11CLA)为十八碳不饱和二烯酸,具有多种生物活性,提高机体免疫调节能力是其重要功能之一。具备c9,t11CLA合成能力的益生菌在肠道内具有持续转化饮食中亚油酸(LA)的能力,从而不断为机体提供c9,t11CLA,进而提高其免疫调节能力,促进人体健康发展。本研究首先采用有效筛选路线,筛选在人体内潜在的能够合成c9,t11CLA能力的益生菌菌株,然后研究了环境及饮食因素对筛选出菌株(嗜酸乳杆菌F0221)合成c9,t11CLA能力的影响,最后以小鼠为模型考察了菌株在体内合成c9,t11CLA的能力以及对机体免疫调节能力的影响。
　　以分离自中国西部地区传统发酵食品以及人类粪便样品中的193株乳酸菌为出发菌株,采用紫外法初步筛选出12株具有潜在合成CLA能力的菌株,然后采用气相色谱法进一步对这些菌株合成的CLA异构体的种类及含量进行了精确分析,发现分离自发酵食品的G14、M6、Q9和分离自人类粪便的F0721、F0221、IN5.22具有较强合成CLA的能力,而且这些菌株合成的CLA的构型均为c9,t11型。对该6株乳酸菌对胃酸的耐受能力、对胆盐的耐受能力以及对HT-29细胞的黏附能力等进行了评价。菌株F0221显示了较好的益生菌特性,被最终筛选出来,经16SrDNA序列分析技术被鉴定为嗜酸乳杆菌。接着研究了温度、pH值、气体条件和培养时间等因素对菌株F0221合成c9,t11CLA能力的影响,发现该菌株在37℃、pH6.5的厌氧环境中培养40h后c9,t11CLA产量达到最大值,为102.1±12.6μg/mL。
　　研究了吐温20、吐温40、吐温60和吐温80对菌株F0221在含胆盐的回肠模拟液中繁殖和合成c9,t11CLA能力的影响,发现四种吐温均能显著(P<0.05)降低菌株在含胆盐环境中的胞内物质的泄漏程度,进而有效提高了菌株的繁殖能力,然而只有吐温80可显著(P<0.05)提高菌株单位细胞在含胆盐的环境中的LA异构酶的产量,进而增强了菌株单位细胞合成c9,t11CLA的能力。该现象发生的重要原因之一是吐温80提高了菌株细胞内18:1(c9)和19:0(cyc)脂肪酸的比例,进而提高了细菌细胞膜的流动性。
　　研究了不同益生元对菌株F0221在结肠模拟液中繁殖及合成c9,t11CLA能力的影响,发现低聚半乳糖(GOS)阿拉伯半乳糖(AG)对菌株繁殖及合成c9,t11CLA能力具有显著(P<0.05)促进作用。分析原因发现,GOS的代谢产物葡萄糖和半乳糖、AG的代谢产物半乳糖通过促进菌株繁殖能力,提高了c9,t11CLA的合成能力。此外,葡萄糖和半乳糖的糖代谢产物乙酸、丙酸和乳酸通过增加菌株F0221细胞膜的渗透性,增强了底物LA进入细胞的能力,提高了细胞内LA与镶嵌于细胞膜上的LA异构酶的接触频率,从而增强菌株单位细胞合成c9,t11CLA的效率。
　　以小鼠为模型,对菌株F0221的体内繁殖、c9,t11CLA合成及免疫调节能力进行了研究。摄食菌株F0221后,小鼠回肠和结肠内乳杆菌数量显著(P<0.05)增加,这提示该菌株具有短期、潜在的在小鼠回肠和结肠上皮细胞定植的能力。同时,小鼠肠道内容物中c9,t11CLA含量显著(P<0.05)增加,说明该菌株在小鼠体内同样具有合成c9,t11CLA的能力。肠道内合成的c9,t11CLA转移到了血清、肝脏和脂肪组织中,降低其中花生四烯酸水平、抑制了具有下调机体免疫调节能力的前列腺素(PGE2)的合成能力。PGE2水平的降低提高了小鼠脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖能力、腹腔巨噬细胞的增殖能力以及血清中细胞因子IL-2和TNF-α的水平,进而提高了机体免疫调节能力。研究了吐温80和GOS对菌株F0221在小鼠体内合成c9,t11CLA能力和调节机体免疫能力的影响,发现吐温80和GOS可显著(P<0.05)提高菌株体内合成c9,t11CLA的能力,进而增强了其对机体免疫能力的调节作用。这提示吐温80和GOS可以作为菌株F0221体内发挥免疫调节功能的促进剂。

目录

合成共轭亚油酸益生菌的筛选及其免疫调节功能研究

SCREENING PROBIOTIC WITH HIGH CAPACITYOF PRODUCING CONJUGATED LINOLEIC ACIDAND ITS IMMUNOMODULATORY FUNCTION

摘 要

Abstract

目 录

Contents

第1 章 绪 论

1.1 课题背景及研究的目的和意义

1.2 CLA 研究进展

1.3 益生菌合成CLA 研究进展

1.4 课题来源及主要研究内容

第2 章 实验材料与方法

2.1 实验材料与仪器和设备

2.2 测定方法

2.3 实验方法

2.4 数据处理与统计分析

第3 章 具有合成CLA 能力益生菌的筛选

3.1 引言

3.2 具有合成CLA 能力菌株的筛选

3.3 菌株益生菌特性的比较

3.4 菌株鉴定及表观形态观察

3.5 影响菌株F0221 繁殖及合成CLA 的因素

3.6 本章小结

第4 章 吐温对菌株F0221 繁殖及合成CLA 能力的影响

4.1 引言

4.2 菌株F0221 在回肠模拟液中繁殖及合成CLA 能力研究

4.3 不同吐温对菌株F0221 在回肠模拟液中繁殖及合成CLA 能力的影响

4.4 吐温增强菌株F0221 繁殖及合成CLA 能力的机制

4.5 本章小结

第5 章 益生元对菌株F0221 繁殖及合成CLA 能力的影响

5.1 引言

5.2 菌株F0221 益生元的筛选

5.3 GOS 和AG 代谢产物对菌株F0221 合成CLA 能力的

5.5 本章小结

5.4 单糖和SCFAs 提高菌株F0221 合成CLA 能力的途径

第6 章 菌株F0221 体内合成CLA 能力及免疫调节功能

6.1 引言

6.2 动物模型及给菌方式和实验分组的确立

6.3 小鼠生长情况及食物摄入量

6.4 菌株F0221 在饮用水中24 h 内存活情况

6.5 小鼠肠道内容物中各种细菌活菌数

6.6 小鼠回肠和结肠内容物中CLA 的含

6.7 小鼠血清、肝脏及腹部脂肪组织中脂肪酸组成的变化

6.8 小鼠机体免疫调节能力研究

6.9 本章小结

结 论

参考文献

附录一

附录二

攻读博士学位期间发表的学术论文

哈尔滨工业大学学位论文原创性声明及使用授权说明

致谢

个人简历