流式细胞术检测牛乳中大肠杆菌数及细菌总数的研究

摘要

目的：生乳营养物质丰富，微生物繁殖速度快。传统的检测方法操作繁琐、耗时长，给企业的正常生产带来不便，甚至经济损失。所以要求一种能在短时间内检测出微生物的方法。本课题旨在研究利用流式细胞术快速检测生乳中的细菌总数和大肠杆菌两个微生物指标。 方法：本研究首先建立生乳前处理方法用来排除生乳中大颗粒物质对流式细胞仪检测的干扰；利用PI对全部细菌进行染色，利用荧光抗体ab30522对大肠杆菌进行特异性染色，并对染色条件进行摸索；在流式细胞仪的EXP032 ADC操作系统上建立微生物的检测程序；利用流式细胞术检测细菌总数、大肠杆菌分别与平皿菌落计数法、MPN法进行比较分析。 结果：研究结果如下： 1．生乳前处理方法：取一定量生乳用300目尼龙膜过滤：取200μl生乳置于EP管中，加蛋白酶K(20mg/ml)5μl、TritonX-100 1μl，50℃消化15min；加800μl 0.1M PBS(pH=7.2)；100℃沸水浴5min 14000g离心5min(或10min)，微量进样器小心移去脂肪层和上清，保留沉淀(沉淀即细菌)。 注：当检测乳中总菌数时热处理的参数为100℃沸水浴5min；当检测乳中大肠杆菌时热处理的参数为100℃沸水浴10min。 2．流式细胞术检测生乳中细菌总数的检测流程：生乳前处理；加190μl的0.1MPBS(pH=7.2)重悬沉淀；加PI染液(20μg/ml)10μl，避光染色5min;将样品移入流式管中，0.1MPBS适当稀释；利用EXPO32 ADC操作系统进行分析。 3．流式细胞术检测生乳中大肠杆菌的检测流程：生乳前处理；用稀释倍数为100倍的荧光抗体ab30522 100μl染色20min，0.1M PBS适当稀释。利用EXP032 ADC操作系统进行分析。 4．流式细胞术检测生乳中细菌总数的检测时间为40min;流式细胞术检测生乳中大肠杆菌的检测时间为60min。 5．流式细胞术的最低检测限为单位体积1个细胞；样品中细菌浓度的检测上限是2.4×10<'7>/ml，检测结果接近2.4×10<'7>/ml的样品应该适当稀释再进行检测。 6．将流式细胞术检测生乳中细菌总数与平皿菌落计数法进行比较，结果表明两者呈正的直线相关(P<0.01)，相关程度为显著相关(r=0.9360)；流式细胞术检测生乳中大肠杆菌和MPN法检测结果的对数值具有显著的相关性(r=0.96，P<0.01，)，两者拟合的回归方程为y=1.2443x-1.4718。 结论：流式细胞术能够极大程度上缩短检测时间，能够达到生乳样品进行在线检测的要求。流式细胞术的结果与传统方法检测的结果具有显著的相关性，结果可靠。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1立题背景

1.2国内外研究进展

1.3流式细胞术的发展概况

1.3.1仪器概况及其基本原理

1.3.2荧光素的选择

1.3.3 FCM在微生物学中的应用

1.3.4 FCM在检测生乳面临的问题

1.4研究的主要内容

2材料与方法

2.1材料与设备

2.1.1菌种来源

2.1.2实验原料

2.1.3生化试剂

2.1.4仪器及设备

2.2试验方法

2.2.1菌种的保藏和活化

2.2.2 E.coli、S.aureus种子液制备

2.2.3样品的制备

2.2.4 E.coli、S.aureus生长曲线的绘制

2.2.5牛乳前处理条件的确定

2.2.6流式细胞术检测乳中细菌总数

2.2.7流式细胞术检测乳中大肠杆菌

3结果与分析

3.1 E.coli、S.aureus生长曲线

3.2牛乳前处理条件的确定

3.2.1酶的择选

3.2.2胰蛋白酶活力的测定

3.2.3胰蛋白酶水解条件的优化

3.2.4蛋白酶K水解条件的优化

3.2.5蛋白质电泳

3.2.6离心条件的确定

3.2.7体细胞的处理条件的优化

3.2.8体细胞处理条件对细菌的影响

3.2.9牛乳的热处理

3.2.10样品前处理的验证

3.3流式细胞术检测乳中细菌总数

3.3.1细菌染色条件

3.3.2流式细胞术的准确性验证

3.3.3流式细胞术的检出限

3.3.4生乳中微生物总数的测定

3.4流式细胞术检测乳中大肠杆菌

3.4.1荧光抗体ab30522染色条件的确定

3.4.2流式细胞术与MPN法检测生乳中大肠杆菌的比较

4讨论

4.1流式细胞术检测生乳中细菌总数

4.2流式细胞术检测生乳中大肠杆菌

5结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学位论文