利用基因枪转化技术创造抗病大豆新材料

摘要

大豆是世界上重要的经济作物，随着人口的增长对大豆的需求量在不断的增加。病害一直是严重影响大豆产量和品质的重要因素之一，危害根部病害主要是:立枯病、猝倒病、萎枯病，据调查每年由于根腐病造成大豆减产在10％左右，严重影响大豆产业的发展。因此，如何提高大豆的抗病性是人们亟待解决的问题，传统育种方式虽然能解决大豆的抗病性，但是需要的时间长，新培育的品种抗性比较单一，通过栽培管理和喷施农药在一定程度上能够减少大豆病害的影响，但是长期喷施农药不仅污染环境，而且会提高植物病原菌的抗药能力。
　　 随着分子生物学的发展，人们对植物抗病基因工程研究的不断深入，人们可以有目的的将抗病基因转入植物体内，用来提高植物广谱的、持久的抗病能力。同时还为大豆的育种提供新的种质资源，植物病原细菌的hrp(hypersensitive reaction and pathogenicity gene)基因编码harpin蛋白能诱导植物产生一系列抗性反应，使植物获得广谱的抗病能力和促进植物的生长。Harpin蛋白是受hrp基因调节并通过Ⅲ型泌出通道分泌的一类蛋白质，它们的共同特点是:富含甘氨酸，对热稳定，对蛋白酶敏感。hrpZPsta是从丁香假单胞菌烟草致病变种(Pseudomonassyringae pv.tabaci) Psta218菌株中克隆，该基因大小约为420bp，能在烟草上引起过敏反应诱导植物的抗病性。
　　 体细胞胚是基因枪转化方法重要的靶组织，主要是通过未成熟子叶体细胞胚诱导途径发生，体细胞胚的诱导对大豆的基因型有很大的依赖性。不同大豆基因型诱导体细胞胚的质量是有差异的。基因枪转化方法不仅转化效率高且操作简单，是大豆重要的遗传转化方法之一。
　　 本试验构建了pDT-hrpZ植物表达载体，选取北方41个春大豆进行体细胞胚诱导，利用基因枪方法将hrpZ基因转入大豆未成熟子叶体细胞胚中。并对转基因植株进行了分子生物学检测。结果表明:
　　 1.垦丰23的体细胞胚的发生率最高为99.7％，并且体细胞胚鲜绿色呈葡萄状、每个未成熟子叶上的体细胞胚数目多，是大豆遗传转化理想受体材料。体细胞胚发生率为70％～90％有合丰55等9个基因型;登科4等5个基因型无体细胞胚发生率。
　　 2.以垦丰23为受体，采用基因枪转化技术，PCR检测，获得转化质粒pDT-hrpZ的T0转基因植株11株。
　　 3.利用荧光定量PCR对11株转基因植株进行实时检测，hrpZ在转基因植株均有不同程度的表达。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究目的及意义

1．2 文献综述

1．2．1 作物抗病育种现状

1．2．2 植物抗病基因工程的研究进展

1．2．3 转基因大豆研究进展

1．2．4 大豆遗传转化方法

1．2．5 再生系统

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 受体材料

2．1．3 生化试剂

2．1．4 培养基

2．1．5 仪器

2．2 试验方法

2．2．1 植物表达载体pDT-hrpZ构建

2．2．2 大豆再生体系的建立

2．2．3 用基因枪法转化大豆体细胞胚

2．2．4 抗性植株分子生物学检测

3 结果与分析

3．1 pDT-hrpZ表达载体的构建

3．2 大豆再生体系的建立

3．2．1 不同基因型对大豆体细胞胚诱导的影响

3．2．2 优异基因型大豆品种体细胞胚的特点

3．3 基因枪介导的遗传转化

3．4 转基因植株分子生物学检测

3．4．1 T0代转基因植株的PCR检测

3．4．2 转基因大豆及对照总RNA的提取

3．4．3 T0代转基因植株hrpZ表达量的real-time PCR检测

4 讨论

4．1 大豆未成熟子叶体细胞胚诱导的主要影响因素

4．2 基因枪轰击大豆体细胞胚的影响因素

4．3 标记基因选择

4．4 液体筛选优点

4．5 下一步工作展望

5 结论

5．1 构建了含hrpZ基因植物表达载体

5．2 筛选出体细胞胚分化率较高的基因型大豆

5．3 获得了转HrpZ基因大豆植株

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文