Lactococcus lactis有氧呼吸末期乳酸利用酶的鉴定及其调控机制的研究

摘要

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L.lactis）是一种具有重要经济价值的乳品微生物，广泛用于多种干酪、酪乳、发酵黄油的生产中。研究表明L.lactis在添加血红素的有氧条件下可以进行呼吸代谢，获得的菌体生长存活性能较比常规的发酵代谢都有大幅的提高。L.lactis有氧呼吸代谢中最独特的一个特征是，当培养基中的葡萄糖消耗尽时菌体可以将环境中的乳酸代谢掉同时乙偶姻、联乙醯、乙酸等风味物质大量积累，菌体生物量也继续提高，这些特征对于L.lactis的生产及应用来说是非常有价值的。然而至目前为止，科学界对L.lactis细胞内能够催化乳酸氧化的酶系以及调控乳酸合成-消耗的机制尚无任何相关报道。因此，本研究的目的就是要探寻L.lactis中催化乳酸利用的酶系并阐明调控乳酸代谢的机制。
　　 本课题分为四大部分。首先用生物信息学的方法初步筛选出可能在L.lactis有氧呼吸末期催化乳酸氧化利用的酶系;然后通过测定在L.lactis有氧呼吸及发酵培养物粗酶中不同类型酶的活性而初步判断出哪种类型的酶占优势;继而在体外表达潜在的利用乳酸的酶并用纯化的重组蛋白进一步深入研究其乳酸氧化活性的大小以及调节其生理活性与乳酸氧化活性的机制;最后，对比发生乳酸氧化之前和之后的细胞内关键代谢物的浓度，以验证细胞内代谢物的变化是否有利于这种酶在有氧呼吸末期催化乳酸的氧化。
　　 首先利用生物信息学筛选L.lactis中可能具有乳酸氧化活性的酶系。结果表明，非黄素含铁硫簇的多亚基乳酸脱氢酶LutABC的同源蛋白编码基因在L.lactis中普遍存在。由于LutABC蛋白复合物在Bacillus subtilis168中具有L-iLDH(NAD-independent L-lactatedehydrogenase)活性，因此L.lactis中LutABC同源物也可能具有L-iLDH活性。另一种具有L-iLDH活性的酶flavocytochrome b2在L.lactis中有两种同源蛋白，一种是乳酸氧化酶，一种是Ⅱ型IPP异构酶，但只有Ⅱ型IPP异构酶能够同时满足在L.lactis有氧呼吸末期催化乳酸氧化的几个条件，因此可能具备L-iLDH活性并参与有氧呼吸末期L.lacits对乳酸的利用。除已知L-iLDH及其同源物以外，属于发酵型L-nLDH(NAD-dependent L-LDH)的LDHA在L.lactis中也普遍存在并有乳酸氧化活性，因此有可能参与呼吸末期细胞对乳酸的利用。
　　 绘制L.lactis在呼吸及发酵条件下的生物量和代谢产物的时间曲线，分别在两种培养方式的指数生长期和稳定期收集细胞制备粗酶，测定L-nLDH和L-iLDH活性。结果表明，L.lactis的L-iLDH活性非常微弱，与培养方式及培养时期无关。与此不同的是，L.lactis的L-nLDH活性始终非常显著，即便在发生乳酸利用的有氧呼吸稳定期也是如此。
　　 利用pQE30Xa载体构建Ⅱ型IPP异构酶编码基因fni的表达载体，转化E.coli M15进行表达。SDS-PAGE分析表明重组FNI单亚基分子量为41.17 kDa。光谱扫描结果显示FNI属于黄素蛋白。1H NMR分析表明，重组FNI能够有效催化IPP异构化生成DMAPP，证实纯化的重组FNI具有显著的生物学活性。经nLDH和iLDH活性测定，重组FNI的两类乳酸氧化活性都非常低，降低酶的添加量或是向反应体系中加入二价金属离子都会导致活性进一步降低至无法检测到。
　　 本研究设计了一种新的用于测定nLDH的乳酸氧化活性方法，可以测定呼吸条件下NADH的移除对乳酸氧化活性的影响。用pEASY载体表达生成H2O的NADH氧化酶基因noxE，并用2，4-二硝基苯肼测定添加或不添加NoxE时丙酮酸生成量的变化。经测定，重组NoxE具有显著的NADH氧化活性。以新的添加有NoxE的反应体系下测定FNI的乳酸氧化活性，活性没有明显提高。
　　 参照表达fni基因的程序构建LDHA的编码基因ldh的表达载体，最终获得E.coli M15(pREP4，pQELDH)重组菌株。SDS-PAGE分析表明该重组菌株可经诱导表达大小正确的重组蛋白。然而多次测定酶活都检测不到有明显的活性。因此有必要重新构建LDHA的表达菌株。
　　 选用6×His标签位于C端的pEASY载体表达ldh基因。参照表达noxE的程序构建ldh基因的表达载体，获得重组菌株E.coli Transetta(DE3)(pEASY-LDH)。SDS-PAGE分析表明重组LDHA单亚基分子量为37.24 kDa，大小正确。在不添加FBP情况下，LDHA的丙酮酸还原活性很微弱;当添加1mM的FBP(fructose1，6-bisphosphate)后，丙酮酸还原活性骤然提高了7000多倍。结果表明，利用pEASY载体构建的表达菌株能够表达具有显著L-nLDH活性的重组LDHA，这种活性强烈依赖于FBP的激活。
　　 酶动力学研究表明LDHA对正反应底物的亲和力以及催化正反应的最大速率都要显著高于逆反应，因此LDHA倾向于催化丙酮酸还原反应。FBP和磷酸盐对LDHA活性影响的实验结果表明，FBP和磷酸盐对LDHA的活性有显著的调节作用。然而二者对两个方向反应的激活或抑制程度是相同的，因而不会改变反应平衡。结果表明，腺嘌呤核苷酸对LDHA具有抑制作用，ATP对正、逆反应的抑制微弱而且程度相似。ADP的抑制作用明显，属于竞争性抑制类型。整体而言，ADP对逆反应有相对抑制作用，然而这种抑制程度强烈依赖于NADH、NAD、ADP之间的浓度关系。
　　 实验证实，NADH/NAD比率对反应平衡影响很大。LDHA的丙酮酸还原活性在很宽泛的NADH/NAD范围内受到的影响不大。另一方面，逆反应速率只在NADH/NAD比率很低时才显著。进一步研究发现，LDHA对丙酮酸的亲和性随着NADH浓度的降低而降低。乳酸对正反应的抑制作用很弱，而丙酮酸对逆反应有着强烈的抑制作用。
　　 利用本研究设计的方法来评估LDHA在NADH可以被移除的条件下乳酸氧化活性的变化。结果表明，在添加NoxE后LDHA的乳酸氧化活性提高了2.84倍。因此在有氧呼吸条件下，LDHA催化乳酸氧化的活性会明显提高。
　　 细胞内代谢物分析结果表明，胞内ADP的浓度在有氧呼吸指数生长期和稳定期始终维持在一个很低的水平，胞内NAD的浓度也基本维持恒定。然而当培养物进入到稳定期以后，胞内NADH和丙酮酸的浓度显著降低。根据上述结果，稳定期细胞内关键代谢物的浓度利于LDHA催化乳酸氧化反应。
　　 本研究首次证实发酵型nLDH负责催化L.lactis有氧呼吸末期乳酸的氧化并提出发生乳酸氧化的先决条件以及相关的转运和代谢途径，为调节乳酸菌乳酸代谢奠定了理论基础，也为在模拟生理条件下测定酶的活性提供了新思路。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 立题背景

1．2 文献综述

1．2．1 乳酸乳球菌的简介

1．2．2 L．lactis的有氧呼吸代谢

1．2．3 L．lactis的丙酮酸代谢及其调节

1．2．4 催化L-乳酸氧化生成丙酮酸的酶

1．3 本研究的目的和意义

1．4 课题来源

1．5 本论文的主要研究内容

2 材料与方法

2．1 材料与设备

2．1．1 实验菌株与载体

2．1．2 合成的引物

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 主要试剂及试剂盒

2．1．5 软件及网络资源

2．2 实验方法

2．2．1 主要试剂的配制

2．2．2 L．lactis MG1363中L-LDH活性的测定

2．2．3 重组fni基因表达菌株的构建

2．2．4 重组FNI的表达纯化及活性测定

2．2．5 NADH氧化酶表达菌株的构建

2．2．6 用pQE表达载体构建ldh的表达菌株

2．2．7 用pEASY载体构建ldh的表达菌株

2．2．8 细胞内代谢物的测定

3 结果与分析

3．1 生物信息学评估催化乳酸氧化的酶

3．1．1 非黄素含铁硫簇多亚基蛋白同源物

3．1．2 含黄素和铁硫簇蛋白的同源物

3．1．3 α-羟酸脱氢酶同源蛋白

3．1．4 L-nLDH催化乳酸氧化的可能性

3．2 L．lactis呼吸及发酵培养物的LDH活性

3．2．1 L．lactis呼吸及发酵培养物的生长曲线

3．2．2 L．lactis呼吸及发酵培养物的LDH活性

3．3 重组FNI的表达纯化及酶学性质分析

3．3．1 fni基因表达载体的构建

3．3．2 重组FNI的SDS-PAGE分析

3．3．3 重组FNI产物的光谱扫描

3．3．4 NMR测定重组FNI的Ⅱ型IPP异构酶活性

3．3．5 重组FNI乳酸脱氢酶活性的测定

3．4 重组NoxE的表达纯化及性质测定

3．4．1 noxE基因表达载体的构建

3．4．2 NoxE纯化产物的SDS-PAGE分析

3．4．3 重组NoxE的光谱吸收特性

3．4．4 NoxE活性及对FNI乳酸氧化活性的影响

3．5 重组LDHA表达菌株的构建

3．5．1 利用pQE载体构建LDHA表达菌株

3．5．2 利用pEASY载体构建LDHA表达菌株

3．6 重组LDHA酶学性质的测定

3．6．1 LDHA的酶促动力学分析

3．6．2 效应物对LDHA活性的影响

3．6．3 腺嘌呤核苷酸对LDHA活性的影响

3．6．4 底物和产物浓度对LDHA活性的影响

3．7 NoxE对LDHA乳酸氧化活性的影响

3．8 呼吸培养物细胞内代谢物分析

4 讨论

4．1 呼吸代谢的发生时期

4．2 有氧呼吸积累更高生物量的原因

4．3 L．lactis利用乳酸的独特性

4．4 FNI不具备显著LDH活性的分析

4．5 LutABC蛋白复合物的功用

4．6 重新审视L-nLDH的乳酸氧化能力

4．7 L．lactis乳酸氧化依赖于培养时期

4．8 乳酸氧化依赖于有氧呼吸培养方式

4．9 呼吸培养物利用乳酸的必然性分析

4．10 模拟体内环境的酶活测定体系

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文