miR--486对奶牛乳腺发育和泌乳功能基因Pten的表达调控

摘要

MicroRNAs(miRNAs)是一类在进化上具有保守性的一类基因，其表达具有组织特异性以及时期特异性，并且可以调控生物体的发育过程以及生物体内其它基因的表达。miRNAs在哺乳动物有机体的生长、发育及其细胞分化、增殖、凋亡等生命现象中具有重要并且广泛的调节作用，并且，生物研究领域及与其交叉的学科，已经将miRNAs视为其研究的重点。近些年，随着miRNAs在正常乳腺发育过程及泌乳的调控中的研究陆续增多，将miRNAs在乳腺中的作用的研究也会更加深入。miR-486在不同种细胞中有不同的功能，而且，本实验室已经利用芯片技术分析并且证实了miR-486在不同品质奶牛乳腺中的表达有差异。Pten作为肿瘤抑制因子，在肿瘤中被广泛研究，但在正常乳腺发育过程中的研究却只是冰山一角，尤其其在奶牛乳腺中的研究就更鲜有报道。 本研究以miR-486作为研究对象，在targetscan（http://www.targetscan.org）网站上预测的靶基因中选择Pten作为其目标靶基因，研究其如何调节奶牛乳腺发育过程及其泌乳过程。所以，本研究以Pten与miR-486之间的作用作为重点，结果证实，在奶牛乳腺上皮细胞中，Pten确实受到miR-486基因的调控，从而证明miR-486对奶牛乳腺发育过程及其泌乳过程有重要的调控作用。 结果显示: 1)利用实时荧光定量PCR技术检测各个乳品质奶牛乳腺组织中miR-486的表达量，结果与实验室的芯片结果趋势相同;结合原位杂交技术证实，miR-486在高乳品质奶牛中表达量较高，在低乳品质奶牛及干奶期奶牛中表达量相似;构建Pten3'UTR序列载体，在HEK-293细胞中进行双荧光素酶活性检测与分析，证实miR-486作用于Pten，预测结果正确。 2)将miR-486 mimics及mir-486 inhibitor分别转染入奶牛乳腺上皮细胞中，结果发现，转染miR-486 mimics后，Pten蛋白的表达量降低，细胞内，其下游与泌乳有关的信号分子AKT蛋白、mTOR蛋白以及β-酪蛋白的表达量均升高;然而，转染miR-486 inhibitor后，Pten蛋白的表达量升高，细胞内，其下游与泌乳有关的信号分子AKT蛋白、mTOR蛋白以及β-酪蛋白的表达量降低。因此，推测miR-486通过调控Pten基因的表达，进而调控上述与乳腺发育及泌乳密切相关的重要基因的表达。 3)在奶牛上皮细胞中过表达miR-486后，利用免疫荧光技术揭示，miR-486的表达可以调控Pten在奶牛乳腺上皮细胞中的位置;利用CCK-8检测细胞活性、Edu技术DNA增殖情况以及利用流式细胞术检测细胞周期，从不同方面证实miR-486促进奶牛乳腺细胞的活性以及增殖能力。在奶牛乳腺上皮细胞中抑制miR-486后，结果则相反。 4)分别利用乳糖、乳脂、乳蛋白检测试剂盒检测过表达miR-486后，细胞分泌物中乳糖、乳脂以及乳蛋白的表达量均升高;而抑制miR-486后，细胞分泌物中乳糖、乳脂以及乳蛋白的表达量均有所降低。证实miR-486对乳中的成分具有调节的作用。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 奶牛乳腺组织的发育

1．2 miRNAs的研究现状

1．2．1 miRNAs的发现以及命名

1．2．2 miRNAs生物学特征

1．2．3 miRNAs的生成过程

1．2．4 miRNAs的功能

1．2．5 miRNAs的检测技术

1．3 miRNA与奶牛乳腺发育的研究现状

1．4 miR-486的研究概况

1．5 Pten基因的研究

1．6 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 验证bta-miR-486在奶牛乳腺组织与芯片结果差异

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要试剂和耗材

2．1．3 主要仪器

2．1．4 RNA提取

2．1．5 RNA质量检测

2．1．6 实时荧光定量PCR

2．2 miR-486在奶牛乳腺组织中的表达

2．2．1 主要试剂和耗材

2．2．2 主要仪器

2．2．3 原位杂交具体步骤

2．3 靶向奶牛Pten基因的bta-miR-486荧光素酶载体构建

2．3．1 主要试剂和耗材

2．3．2 主要仪器

2．3．3 靶基因的预测

2．3．4 奶牛乳腺组织总RNA的反转录

2．3．5 目的片段的扩增与纯化

2．3．6 含目的片段的T载体质粒构建与测序

2．3．7 含目的片段的荧光素酶报告基因重组质粒载体的构建与测序

2．4 靶基因验证

2．4．1 主要试剂和耗材

2．4．2 主要仪器

2．4．3 HEK-293细胞的传代培养

2．4．4 双荧光素酶活性的检测

2．5 奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定

2．5．1 主要试剂和耗材

2．5．2 主要仪器

2．5．3 奶牛乳腺上皮细胞的培养

2．5．4 乳腺上皮细胞鉴定

2．6 bta-miR-486 mimics对奶牛乳腺上皮细胞的影响

2．6．1 主要试剂和耗材

2．6．2 主要仪器

2．6．3 miR-486 mimics转染奶牛乳腺上皮细胞

2．6．4 miR-486 mimics对奶牛乳腺上皮细胞miR-486基因、Pten及其下游信号通路基因表达的影响

2．6．5 miR-486 mimics对奶牛乳腺上皮细胞Pten蛋白表达的影响

2．6．6 miR-486 mimics对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

2．6．7 miR-486 mimics对乳腺上皮细胞的影响

2．6．7 免疫组化

2．7 miR-486 inhibitor对奶牛乳腺上皮细胞的影响

2．7．1 主要试剂和耗材

2．7．2 主要仪器

2．7．3 miR-486 inhibitor转染奶牛乳腺上皮细胞

2．6．4 miR-486 inhibitor对奶牛乳腺上皮细胞miR-486基因、Pten及其下游信号通路基因表达的影响

2．7．5 miR-486 inhibitor对奶牛乳腺上皮细胞Pten蛋白表达的影响

2．7．6 miR-486 inhibitor对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

2．7．7 miR-486 inhibitor对乳腺上皮细胞的影响

2．7．8 免疫组化

2．8 数据统计处理与统计分析

3 结果

3．1 奶牛乳腺组织RNA提取质量检验结果

3．2 miR-486在奶牛乳腺组织中的表达

3．3 验证bta-miR-486在奶牛乳腺组织与芯片结果差异

3．4 奶牛乳腺上皮细胞的培养及鉴定

3．5 靶向奶牛Pten基因的miR-486荧光素酶载体构建

3．5．1 miR-486靶基因预测结果

3．5．2 报告基因载体的构建与鉴定

3．5．3 荧光素酶活性检测

3．6 miR-486超表达对奶牛乳腺上皮细胞的影响

3．6．1 miR-486超表达对奶牛乳腺上皮细胞中Pten蛋白位置的影响

3．6．2 miR-486超表达对奶牛上皮细胞活性的影响

3．6．3 miR-486超表达对奶牛上皮细胞DNA增殖率的影响

3．6．4 miR-486超表达对奶牛乳腺上皮细胞周期的影响

3．6．5 miR-486超表达对奶牛乳腺上皮细胞miR-486、Pten及下游信号通路基因的表达

3．6．6 miR-486超表达对奶牛乳腺上皮细胞Pten及下游信号通路基因蛋白表达的影响

3．6．7 miR-486超表达对奶牛上皮细胞泌乳功能影响的结果

3．7 miR-486基因沉默对奶牛乳腺上皮细胞的影响

3．7．1 miR-486基因沉默对奶牛乳腺上皮细胞中Pten蛋白位置的影响

3．7．2 miR-486基因沉默对奶牛上皮细胞活性的影响

3．7．3 miR-486基因沉默对奶牛上皮细胞细胞DNA增殖率的影响

3．7．4 miR-486基因沉默对奶牛乳腺上皮细胞周期的影响

3．7．5 miR-486基因沉默对奶牛乳腺上皮细胞miR-486、Pten及下游信号通路基因的表达

3．7．6 miR-486基因沉寂对奶牛乳腺上皮细胞Pten及下游信号通路基因蛋白表达的影响

3．7．7 miR-486基因沉默对奶牛上皮细胞泌乳功能影响的结果

4 讨论

4．1 靶基因的预测及鉴定

4．2 miR-486在奶牛乳腺组织的表达

4．3 miR-486对乳腺上皮细胞泌乳信号转导途径的影响

4．4 miR-486对奶牛乳腺细胞增殖和泌乳的作用及其机制

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文