声明
摘要
1引言
1．1 CRISPR／Cas9系统
1．1．1 CRISPR系统的发现
1．1．2 CRISPR系统的结构
1．1．3 CRISPR系统的类型
1．1．4 CRISPR系统的作用机制
1．2 CRISPR／Cas9系统介导的基因编辑
1．2．1 CRISPR／Cas9系统介导的基因编辑原理
1．2．2 CRISPR／Cas9系统与哺乳动物基因编辑
1．2．3多途径介导的CRISPR／Cas9系统的应用
1．2．4 Cas9变体及其应用
1．2．5 CRISPR／Cas9系统与传统基因编辑技术的比较
1．2．6 CRISPR／Cas9系统应用的局限性
1．3 CRISPR／Cas9系统介导的敲除文库及应用
1．3．1 CRISPR／Cas9系统介导的敲除文库
1．3．2 CRISPR／Cas9系统介导的敲除文库构建策略
1．3．3传统CRISPR／Cas9系统介导的敲除文库构建方法的局限性
1．4非合成策略构建基因组敲除文库
1．4．1酶处理策略构建基因组敲除文库
1．4．2随机断裂处理策略构建基因组敲除文库
1．4．3非合成策略构建敲除文库的优势
1．4．4非合成策略构建敲除文库的待优化条件
1．5酶处理策略的相关限制性内切酶
1．5．1 TypeIIS型限制性内切酶及其应用
1．5．2限制性内切酶MspI及其应用
1．6本研究的目的和意义
2材料与方法
2．1实验材料
2．1．1实验动物
2．1．2主要仪器设备
2．1．3限制性内切酶
2．1．4主要试剂及试剂盒
2．1．5常用试剂配制
2．1．6主要生物信息分析软件及网站
2．2实验方法
2．2．1常规分子实验方法
2．2．2常规细胞实验方法
2．2．3酶切-三级文库策略构建敲除文库方法
2．2．4检测分析
2．2．5高通量测序数据分析
3结果与分析
3．1 CRISPR／Cas9系统介导的基因敲除效率验证
3．1．1 PKpG细胞系的获得及特征鉴定
3．1．2针对EGFP的guide RNA设计及载体构建
3．1．3 EGFP基因敲除效率验证流程及效率检测
3．1．4短guide RNA对EGFP基因敲除效率的影响
3．2酶处理策略构建CRISPR／Cas9敲除文库的探索与优化
3．2．1酶切-接头法的敲除文库构建策略及建库初探
3．2．2限制性内切酶MmeI的反应条件
3．2．3酶切-三级文库法的敲除文库构建策略探索与优化
3．3酶切-三级文库法构建敲除文库——以pEGFP-C1质粒为例
3．3．1敲除文库构建流程
3．3．2一级文库f．MspI文库的构建及检测
3．3．3二级文库PAM-F文库的构建及检测
3．3．4三级文库lenti文库的构建及检测
3．3．5针对pEGFP-C1质粒的敲除文库验证流程
3．3．6针对pEGFP-C1质粒的敲除文库效率的验证
3．4酶切-三级文库法构建敲除文库——以小鼠、猪基因组为例
3．4．1针对小鼠、猪基因组敲除文库的构建流程
3．4．2针对小鼠、猪基因组的f．MspI文库构建
3．4．3针对小鼠、猪基因组的PAM-F文库及lenti文库构建
4讨论
4．2酶切-三级文库策略的优势
4．2．1与合成策略比较
4．2．2与酶处理策略相关研究比较
4．2．3 MspI介导的PAM定位优势
4．3酶切-三级文库策略的不足
4．3．1 MspI识别位点的局限性
4．3．2对非编码区的敲除效率
4．4展望
4．4．1敲除文库的筛选应用
4．4．2待优化的建库策略
5结论
致谢
参考文献
攻读博士学位期间发表的学术论文
