山新杨遗传转化条件筛选与转几丁质酶基因研究

摘要

山新杨(Populus davidiana Dode×P.bollena Lauche)以黑龙江野生山杨为母本，新疆杨为父本的人工杂交种。虽然山新杨和其杨树他品种相比具有一定的抗病性，但也常常遭受病原菌的侵染而引起大面积流行，给林业生产和生态建设造成巨大的损失。针对杨树病害种类多、流行快、危害重的实际，本文以山新杨为受体材料、以几丁质酶为目的基因，通过农杆菌介导的叶盘法进行了抗真菌病害转山新杨的研究。
　　1、以1/2MS附加0.03 mg/La-萘乙酸(NAA)和0.05 mg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)为叶片分化培养基、1/2MS附加0.05 mg/La-萘乙酸(NAA)和0.05 mg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)为茎段分化培养基和1/2MS附加0.25 mg/La-萘乙酸(NAA)为生根培养基对山新杨进行组培和扩繁，为遗传转化提供优良的受体材料。
　　2、通过抗生素的敏感性实验，分别确定了山新杨叶片转化中卡那霉素最佳临界浓度为8 mg/L、生根筛选培养的最佳临界浓度为40 mg/L、头孢噻肟钠除菌最佳浓度为800 mg/L。
　　3、以山新杨叶片为受体材料进行遗传转化，菌液的侵染最适浓度为OD600≤0.1、最佳侵染时间为5min。在该组合条件下，共培养基中不添加CoCl2·6H2O比添加CoCl2·6H2O的分化率提高1倍以上，转化率提高近1倍。
　　4、根据正交试验设计确定了影响农杆菌介导的山新杨遗传转化率的菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮和共培养时间四种因素的最佳组合。建立了以1/2MS液体培养基附加50μmol/L乙酰丁香酮于28℃、180 rpm振荡培养12～14h;菌液离心收集菌体后用1/2MS液体培养基悬浮稀释至OD600=0.1，侵染2～5min;共培养培养基中去除CoCl2·6H2O并附加200μmol/L乙酰丁香酮，共培养3d为最佳转化体系。
　　5、以生长10～15d的山新杨组培苗叶片为受体材料，利用优化的农杆菌介导组合对324个叶片进行转化，共得18株卡那抗性芽，经PCR检测，有14株抗性芽出现了特异性扩增条带，阳性率达77.78％，再对14株PCR检测阳性植株进行PCR-Southern检测，均出现了与阳性对照相同的杂交带，阳性率达100％，转化率为4.3％，进一步证明几丁质酶基因已经成功整合到山新杨基因组中。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景(或引言)

1．2 植物抗真菌基因工程研究

1．2．1 抗真菌蛋白基因

1．2．2 植物抗病基因

1．2．3 植物防卫基因

1．3 我国杨树转基因研究概况

1．4 山新杨简介

2 材料及方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 工程菌

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 试验试剂

2．2 方法

2．2．1 山新杨继代培养

2．2．2 抗生素敏感性试验

2．2．3 菌种的活化

2．2．4 碱法提取质粒DNA

2．2．5 菌种的PCR分子检测

2．2．6 农杆菌介导法

2．2．7 转化植株分子检测

2．2．8 转化植株的扩繁

2．3 本章小结

3 结果与分析

3．1 山新杨继代培养

3．1．1 叶片再生芽获得

3．1．2 茎段抽茎

3．1．3 茎段生根

3．2 抗生素种类及浓度与山新杨分化、生根的关系

3．2．1 卡那霉素对叶片分化的影响

3．2．2 头孢噻肟钠浓度与叶片分化的关系

3．2．3 卡那霉素对山新杨生根及生长的影响

3．2．4 头孢霉素对茎段生根及生长的影响

3．2．5 头孢噻肟钠抑菌浓度筛选

3．3 菌液浓度及侵染时间与转化率的关系

3．4 钴元素对叶片分化和转化的影响

3．5 四种因素不同组合对遗传转化的影响

3．5．1 工程菌制备方式与分化和转化的关系

3．5．2 菌液浓度对转化的影响

3．5．3 乙酰丁香酮与转化率的关系

3．5．4 共培养时间与转化率的关系

3．6 转基因植株的分子检测

3．6．1 工程菌质粒DNA的PCR检测

3．6．2 山新杨基因组DNA提取

3．6．3 山新杨转化植株PCR检测

3．6．4 转基因植株的PCR-Southern分子杂交检测

3．6．5 转化植株的扩繁

3．7 本章小结

结论与讨论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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