石油污染土壤的微生物修复及对相关土壤细菌群落多样性的影响

摘要

石油在成为能源与经济核心的同时，也给土壤环境造成了严重的污染。建立经济、高效的石油污染土壤生物修复方法是十分重要的。通过高通量测序技术分析生物修复技术对土壤微生物群落多样性的影响，解析功能微生物以及优势菌群间的互作关系，可以为开展石油污染区域修复提供理论和实际的指导意义。
　　本研究利用稀释平板法从石油污染土壤中分离得到9株高效降解石油真菌，通过形态学观察、生理生化性质测定及ITS序列的比对结果，确定1＃、4＃、7＃和8＃菌株属于镰孢霉属(Fusarium sp.);3＃和W9菌株属于曲霉属(Aspergillus sp.);19＃菌株属于假霉样真菌属（Pseudallescheria sp.）;W2属于正青霉属（Eupenicillium sp.）;W19属于白僵菌属（Beauveria sp.）。
　　在电热控温的基础上，以有机质添加剂、表面活性剂和供氧为主要实验因素，利用筛选的9株降解石油真菌进行石油污染土壤微生物修复实验，结果表明:加入真菌的处理原油去除率普遍高于对照组CK的原油去除率，说明了外源真菌增加了土壤中原油的去除率。
　　土温20℃时所有实验处理的原油降解主要集中在0-14d，处理1和处理2在15-28d的原油去除率相对较高。25℃时处理1～处理4以及处理13～处理18的原油去除主要集中在0-14d，其他处理和对照组CK在0-14d和15-28d的原油去除率都较高。30℃时对照组CK、处理1、2、13、14、15和处理16在15-28d的原油去除率较高，其他处理的原油去除主要集中在0-14d。
　　在三个土温条件中，25℃时原油去除率最高(74.80％)，而30℃的原油去除率最低(49.43％)。在同温度内，不同有机质和供氧水平差异都极显著;在20℃和25℃时表面活性剂的不同水平差异显著，在30℃时差异不显著。在同一种表面活性剂处理内，温度、有机质和供氧的不同水平对原油去除率影响达极显著差异。不添加表面活性剂和添加Tween80的两种处理中，在25℃时原油去除率最高，而添加表面活性剂SDS的处理在30℃时原油去除率最高。不添加表面活性剂的处理中，添加玉米芯处理的原油去除率最高;在添加表面活性剂的处理中，添加有机肥处理的原油去除率最高。在相同有机质处理的条件下，25℃时原油的去除率最高。在同样的供氧条件下，温度、有机质和表面活性剂对原油去除率的影响差异极显著。在相同的供氧水平下，25℃时原油去除率最高;添加有机肥的处理原油去除率最高。在不添加供氧剂的处理中，不添加表面活性剂的处理原油去除率最高;在添加供氧剂的处理中，添加表面活性剂SDS的原油去除率最高。
　　根据各处理的原油去除率，确定高寒地区石油污染土壤生物修复的最佳处理方法为:S1W1O1（28d原油去除率为81.46％），即添加表面活性剂Tween80、有机肥和供氧剂H2O2。
　　参考原油去除率和各处理因素挑选13个油污综合修复后的土壤样品，利用454高通量测序分析土壤细菌群落多样性。结果表明:根据细菌16s rRNA基因操作分类单元（基于97％核酸相似度的OTU）的相对丰度，样品J17、J25、J27、J28、J29和J30被聚为一组，样品J1、J2、J8、J11、J12、J21和J22聚为一组。所测得的序列在门的水平主要来自29个门，其中变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为所有样品中的优势菌群，同时这些优势菌群也随着处理的不同而发生改变。在纲水平上13个土壤样品中4个主要的优势纲为:α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria以及Actinobacteria纲;其中，γ-Proteobacteria纲在不同处理的土壤样品间差异较为明显，并且原油去除率与γ-Proteobacteria纲细菌数量成显著正相关（r=0.539*）。在属水平上，多数优势属(Achromobacter sp.、Acinetobactersp.、Arthrobacter sp.、Bacillus sp.、Brevundimonas sp.、Devosia sp.、Flexibacter sp.、Gordonia sp.、Nocardia sp.、Parapedobacter sp.、Pseudomonas sp.以及Sphingomonassp.)具有降解石油烃的能力，还有产生物表面活性剂和具有石油脱硫作用的细菌（Rhodococcus erythropolis），以及还原硝酸盐（Paracoccus sp.）、降解农药（Phenylobacterium sp.、Sphingobium sp.、Sphingopyxis sp.）和与腐殖酸有关的细菌属（Candidatus Chloracidobacterium sp.）。相关分析表明，原油去除率与土壤优势属中石油烃降解细菌的数量成显著的负相关，与其他种类的细菌数量与原油去除率相关不显著。在氧气条件差、有机质含量低的样品中Candidatus Chloracidobacterium sp.细菌的数量相对较低。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．2 油污染土壤修复方法

1．2．1 土地耕作法

1．2．2 菌根植物修复法

1．2．3 堆积处理法

1．2．4 生物反应器法

1．2．5 电动修复法

1．3 影响油污染土壤生物修复的因素

1．3．1 微生物品种的筛选与驯化

1．3．2 动物在油污染土壤生物修复中的作用

1．3．3 植物在油污染土壤生物修复中的作用

1．3．4 生物修复中其他因子的影响

1．4 高通量测序在土壤微生物研究中的应用

1．4．1 土壤微生物研究现状

1．4．2 土壤微生物研究中高通量测序技术的应用

1．5 本研究的目的和主要内容

1．5．1 研究的目的

1．5．2 研究的主要内容

1．6 研究技术路线

2 石油降解真菌菌种的筛选与鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 土壤及石油样品

2．1．2 培养基配方

2．2 实验方法

2．2．1 降解石油真菌的分离

2．2．2 菌株的生长速度测定

2．2．3 单菌株去除石油能力测定

2．2．4 真菌的形态学观察及理化性质测定

2．2．5 真菌DNA的提取与PCR扩增

2．2．6 石油样品的萃取与降解率计算(重量法)

2．3 实验结果

2．3．1 降解石油真菌的分离与筛选

2．3．2 高效降解石油真菌的形态学观察及理化性质鉴定

2．3．3 真菌的分子生物学鉴定

2．4 本章小结

3 电热与非生物添加剂辅助微生物修复石油污染土壤技术研究

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．2．1 菌株增殖液体培养基的优化

3．2．2 电热装置制作

3．2．3 电热、添加剂辅助微生物修复油污染土壤实验设计

3．2．4 石油降解率测定方法

3．2．5 分析方法

3．3 试验结果与分析

3．3．1 真菌液体培养基的优化选择

3．3．2 油污染土壤中原油的去除

3．3．3 油污土壤综合修复主要影响因素的方差分析

3．3．4 温度对石油污染土壤综合修复的影响

3．3．5 表面活性剂对石油污染土壤微生物修复的影响

3．3．6 有机质添加剂对石油污染土壤综合修复的影响

3．3．7 供氧剂对石油污染土壤综合修复的影响

3．4 本章小结

4 石油污染土壤的修复及对相关土壤细菌宏基因组的影响

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．2．1 实验流程

4．2．2 土壤总DNA的提取

4．2．3 土壤细菌DNA的PCR扩增

4．2．4 高通量测序数据分析

4．3 结果与分析

4．3．1 土壤微生物总DNA的提取

4．3．2 土壤微生物总DNA的PCR扩增

4．3．3 基于高通量测序技术的土壤细菌群落多样性分析

4．4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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