地高辛衍生物对豚鼠心室肌细胞Na+,K+-ATPase和在HEK-293细胞中表达的HERG钾电流的影响

摘要

Na+，K+-ATPase是真核细胞的膜结合蛋白，它维持胞内高钾、膜外高钠的不均衡分布，对于调节细胞离子稳态有十分重要的意义，是强心苷类药物的作用靶点。一直以来，强心苷类药物治疗慢性心功能不全的作用机制被认为是通过抑制Na+，K+-ATPase，影响Na+-Ca2+交换体的效率，提高了动作电位期间Ca2+内流，降低了Ca2+外流的动力，增加心肌收缩力。但有研究发现，强心苷类药物毒毛旋花子苷原对Na+，K+-ATPase的作用低浓度呈现兴奋，而高浓度则为抑制作用。地高辛为临床上慢性心功能不全最为有效的治疗药物，但其治疗窗有限，服用常规剂量产生心脏毒性的几率可达到15％，目前地高辛的心脏毒副反应的机制还不十分清楚。因此筛选有一定药理活性且心脏毒副作用小的地高辛衍生物就具有重要的意义。
　　 本研究拟应用全细胞膜片钳技术，以正常离体豚鼠心室肌细胞和体外培养的HEK293细胞为药物筛选模型，以地高辛为阳性对照，观察不同浓度的地高辛衍生物DX-2、DX-5、DX-9、DX-10、DX-11和DX-13对Na+，K+-ATPase和HERG钾通道电流的影响，从中筛选出对Na+，K+-ATPase有活性的化合物，以探讨地高辛衍生物治疗慢性心功能不全可能的离子通道机制；通过研究筛选出对HERG钾通道有抑制作用的化合物，评估地高辛及衍生物对正常心肌细胞潜在的致心律失常的风险。本研究将有助于对地高辛衍生物的作用进行预测及筛选，促进新药设计和研发。
　　 方法：
　　 1.酶解分离豚鼠单个心室肌细胞：棒击豚鼠头部致昏，剖胸取出心脏，以无钙台氏液行主动脉逆行灌流10min，换以酶解液灌流10～15 min，再用高钾液灌流10～15min以冲洗心脏内的残留酶液。取下心脏用吸管缓慢吹打使之分散成单个心室肌细胞。用200μm的微孔尼龙网过滤去除结缔组织和未消化细胞，滤液于室温下静止1h以备用。室温保持在18～22℃之间。
　　 2.细胞培养和瞬时转染：人胚肾上皮细胞(human embryonic kidney cell line，HEK-293细胞)在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养。采用磷酸钙沉淀的方法进行瞬时转染将HERG基因表达于HEK-293细胞上。
　　 3.全细胞膜片钳记录Ip电流和hERG钾通道电流：将豚鼠心室肌细胞悬液和表达有绿色荧光蛋白的HEK-293细胞置于倒置显微镜的工作台上，使用的微电极尖端约0.5～1μm，充以电极内液后阻抗为2-5MΩ。高阻抗封接、破膜后形成全细胞记录模式观察和记录地高辛及衍生物对Ip电流和HERG钾电流的影响。
　　 4.统计处理：所有数值用mean±S.E.M表示，使用pulse8.67软件记录和分析通道电流，采用SPSS13.0和Origin6.0软件来统计数据、拟合曲线和制图，统计比较用t检验和单因素方差分析。检验水准α=0.05。
　　 结果：
　　 1.地高辛及衍生物对Na+，K+-ATPase电流Ip的影响
　　 细胞破膜后，在0mV电压下Ip电流的大小为5.34±1.02 pA/pF，当地高辛的浓度为0.01、10和100μmol/L时，Ip电流依次变化为为：5.72±1.38 pA/pF(P<0.05，n=8)、3.32±0.52 pA/pF(P<0.01，n=8)、1.70±0.23 pA/pF(P<0.01，n=8)，变化率分别为+7.12％、-37.83％、-68.16％；
　　 当灌流液中加入0.01、10和100μmol/L的衍生物DX-13时，Ip电流从加药前的5.29±0.16 pA/pF依次变为：5.67±1.31 pA/pF(P<0.05，n=8)、3.46±0.44pA/pF(P<0.05，n=8))、1.74±0.62 pA/pF(P<0.01，n=8)，变化率分别为：+7.18％、-34.59％、-67.11％。地高辛和DX-13的IC50分别为25.08和28.93 lμmol/L。
　　 其它地高辛衍生物(DX-2、DX-5、DX-9、DX-10和DX-11)对Ip电流的作用均与浓度无明显相关性。
　　 2.地高辛及衍生物对HERG钾电流的影响
　　 地高辛浓度依赖性的抑制HERG钾电流，当地高辛的浓度为1、10和100nmol/L时，时间依赖性电流IHERG的电流从40.94+1.16 pA/pF依次变为：36.35±2.34 pA/pF(P<0.01，n=8)、26.68±4.32 pA/pF(P<0.05，n=8)、7.32±0.72pA/pF(P<0.05，n=8)，抑制率分别为：11.21％、34.83％及82.12％；而尾电流Itail的电流密度则从48.64±3.22 pA/pF变为45.25±2.15 pA/pF(P<0.05，n=8)、33.38±2.33 pA/pF(P<0.05，n=8)、8.27±0.91 pA/pF(P<0.01，n=8)，抑制率分别为：6.97％、31.37％和82.90％。
　　 DX-10对HERG钾电流的影响也呈浓度依赖性，当DX-10的浓度为1、10和100 nmol/L时，IHERG电流从42.98±6.44 pA/pF后依次变为：40.78±4.54、30.58±5.60和24.11±4.77 pA/pF(P均<0.05，n=8)，抑制率分别为：5.12％、28.85％及43.90％；而尾电流Itail则从51.02±5.11 pA/pF变为：46.77±0.80 pA/pF(P<0.05，n=8)、33.52±4.47 pA/pF(P<0.05，n=8)、9.48±3.02 pA/pF(P<0.01，n=8)，抑制率分别为：8.33％、34.30％和81.42％。
　　 同样，DX-13对HERG钾电流的影响也呈浓度依赖性，当DX-13的浓度为1、10、100 nmol/L时，IHERG电流从45.70±2.03 pA/pF依次变为：42.90±2.16 pA/pF(P<0.05，n=8)、28.47±3.44pA/pF(P<0.01，n=8))、23.71±1.89pA/pF(P<0.05，n=8)，抑制率分别为6.13％、37.70％及48.12％;而尾电流Itail的电流密度则从49.07±3.47 pA/pF变为44.45±0.93 pA/pF(P<0.01，n=8)、34.54±1.54pA/pF(P<0.05，n=8)和9.71±2.38 pA/pF(P<0.01，n=8)，抑制率分别为9.42％、29.61％和80.21％。
　　 地高辛的衍生物DX-10、DX-13和地高辛一样，对HERG钾电流抑制的IC50值分别为20.61、22.59和22.69 nmol/L，且它们均对HERG钾通道的动力学曲线没有影响(激活和稳态失活)。
　　 其它地高辛衍生物(DX-2、DX-5、DX-9和DX-11)对HERG电流的作用均未体现出与浓度的相关性
　　 结论：
　　 1.地高辛及衍生物DX-13对Na+，K+-ATPase的Ip电流呈现双向性作用，即低浓度兴奋，高浓度抑制；
　　 2.地高辛及衍生物DX-10、DX-13对HERG钾通道均呈浓度依赖性抑制。

目录

文摘

英文文摘

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

文献综述一Na+,K+-ATPase研究进展

参考文献

文献综述二延迟整流钾电流的研究进展

参考文献

主要缩略词

攻读学位期间发表的文章及研究成果

读硕期间参加学术会议情况

个人简历

致谢