Fox01对游离脂肪酸诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗和脂质堆积作用的研究

摘要

背景与目的：
　　 2型糖尿病(T2DM)是一个严重的全球公共卫生问题,在国内外都有很高的发病率。中国糖尿病协会最新调查发现,糖尿病在中国的发病率已经达到了9.7％。全国糖尿病人接近一个亿,中国已成为全球范围糖尿病增长最快的地区。胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是T2DM发病机制中的一个重要特征,IR不仅是T2DM发病的重要原因,也是高血压、多囊卵巢综合征、动脉粥样硬化等多种疾病的危险因素。近年来,IR在T2DM发生发展中的作用已成为糖尿病发病机制研究中的一个热点课题。
　　 非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是2型糖尿病患者最常合并的肝损伤,目前所公认的发病机制是由胰岛素抵抗和氧化应激、脂质过氧化、炎性细胞因子释放形成的“二次打击”学说,因此,改善胰岛素抵抗和氧化应激从理论上可以对脂肪肝起到保护作用。NAFLD中出现的IR存在两种途径:(1)持续脂质堆积,肝脏继发代谢紊乱,导致肝脏及全身胰岛素抵抗；(2)脂肪因子之间不平衡诱导胰岛素抵抗出现。高脂饮食模型和体外试验中脂肪酸干预肝细胞可产生胰岛素抵抗和内质网应激。
　　 FoxOl是FoxO亚家族中发现最早的成员,广泛表达于成人的各组织器官中,包括下丘脑、肌肉组织、脂肪组织、肝脏等。在空腹状态下,肝脏是血糖水平维持的主要器官,FoxOl是促进糖异生酶表达的关键转录因子。空腹及餐后高游离脂肪酸血症也是胰岛素抵抗状态的一个显著代谢紊乱的特征。
　　 固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding:proteins lc,SREBP-lc)在NAFLD的发病中起重要的作用,是脂肪形成基因的总调节器,也是肝脏中调节脂肪生成的重要的转录因子,与甘油三脂的形成关系密切。脂肪肝和胰岛素抵抗关系的分子机制还没有清晰定义,有研究表明,在RXR／LXR模型中,SREBP-lc表达被FOXOl负向调节。
　　 本实验采用高浓度软脂酸诱导人肝癌细胞株成肝脂肪变模型,抑制FoxOl进行干预,探讨FoxOl对肝脂肪变细胞的作用,以期为治疗防治NALDH、减轻胰岛素抵抗提供新的靶点和依据。
　　 材料与方法：
　　 1.采用高浓度游离脂肪酸(5×10-4mol／L)诱导HepG-2细胞24h,建立IR细胞并脂肪变肝脏细胞模型。
　　 2.实验分组:对照组(普通培养基培养的HepG2细胞组)；软脂酸组(含5×10-4mol／L软脂酸的培养基培养的HepG2细胞组)；空白质粒组(含5×10-4mol／L软脂酸的培养基培养并转染空白质粒的HepG2细胞组)；FoxOlsiRNA载体组(含5×10-4mol／L软脂酸的培养基培养并转染pSIREN-DNR-DsRed—Express-FoxOl质粒的HepG2细胞组)。当细胞处于80％～90％融合时按照Lipofectamine2000说明书进行瞬时转染。
　　 3.荧光显微镜下观察转染情况,FoxOl siRNA载体携带红色荧光标记,在转染后于荧光显微镜下观查细胞内红色荧光的表达量,评估质粒载体转染入细胞的情况。采用RT-PCR技术检测FoxOlmRNA的表达；
　　 4.转染后24h,计数细胞,调整细胞密度,各实验组均传代一次,在含有10-9 mol／L胰岛素的培养液中孵育24h后,MTT检测细胞增殖率减少实验误差,采用葡萄糖氧化酶法检测各组培养基中葡萄糖含量,以不铺细胞的空白孔为对照,计算24h葡萄糖消耗量。
　　 5.油红O染色普通显微镜下观察细胞脂质堆积情况。
　　 6.采用RT-PCR技术和Western blot技术,检测SREBP-lc mRNA表达和蛋白表达。
　　 采用统计软件SPSS12.0行统计学分析,实验所得数值用平均数±标准差((x)±s)表示。,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.胰岛素抵抗HepG2细胞模型的建立
　　 含5×10-4mol／L软脂酸的培养基孵育细胞24h后,模型组细胞葡萄糖消耗量较空白对照组减少约53.6％,差异有显著统计学意义,说明软脂酸孵育后细胞表现出明显的IR。
　　 2.荧光显微镜观察转染细胞和RT-PCR对转染细胞的鉴定
　　 转染后在倒置荧光显微镜下观察转染细胞,可见荧光表达,36h时荧光表达最强。RT-PCR测得FoxOl表达量软脂酸诱导后较对照组表达量显著增高。
　　 3.RT-PCR技术检测FoxOl mRNA表达
　　 各组细胞RT-PCR经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离,在467bp处可见清晰扩增条带,与目的条带位置一致。RT-PCR测得FoxOl表达量软脂酸诱导后较对照组表达量显著增高,转染空白质粒后与软脂酸组差异无统计学意义,转入含FoxOlsiRNA质粒后FoxOl mRNA表达量较软脂酸组显著降低,约51.2％FoxOlmRNA被抑制,说明成功转染pSIREN-DNR-DsRed-Express-FoxOl质粒到细胞中,并有效地发挥抑制效果。
　　 4.葡萄糖消耗量、细胞生长增殖和脂质堆积
　　 含有5×10-4mol／L软脂酸的培养液培养使细胞葡萄糖消耗降低,此降低效应在抑制FoxOl后有所缓解,表现为:软脂酸组和空白质粒组葡萄糖消耗量均较对照组降低； FoxOlsiRNA组葡萄糖消耗量较软脂酸组、空白质粒组均明显增加,但仍低于对照组,各组细胞增殖率比较无统计学意义。
　　 5.油红O染色检测细胞脂质堆积
　　 对照组细胞边缘清晰,核大,细胞内未见橘红色脂滴；软脂酸诱导后细胞内可见许多橘红色的脂滴存在,且大部分细胞内含多个脂滴；转染空白质粒后细胞内仍可见有脂滴存在；转染FoxOlsiRNA质粒载体36h后细胞中橘红色脂滴较软脂酸组和空白质粒组明显减少。
　　 6.SREBP-lc mRNA和蛋白的表达
　　 RT-PCR测量转入含FoxOlsiRNA质粒载体后SREBP-lc mRNA表达量较对照组明显增加,较软脂酸组明显减少,约减少35.7％。
　　 Western blot测量转入含FoxOlsiRNA质粒载体后SREBP-lc蛋白表达量较对照组降低,但差异无统计学意义,较软脂酸组明显降低(P<0.01),约降低40.5％。
　　 结论：
　　 1.高浓度脂肪酸诱导诱导的HepG-2细胞中可发生脂质堆积,导致胰岛素抵抗。
　　 2.FoxOl升高／降低可加重／减轻HepG2细胞胰岛素抵抗,其机制可能是上调／下调SREBP-lc表达,增加／减少脂质蓄积。