肝癌患者肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶活性变化

摘要

肝癌（Liver cancer）是严重危害全人类生命健康的重大疾病之一，每年全世界新患肝癌人数为62.6万人，其中我国占55％。据世界卫生组织统计肝癌已成为我国仅次于胃癌及食道癌的消化系统的恶性肿瘤。肝炎-肝硬化-肝癌，这一肝癌的多阶段发生发展模式己得到病理学及临床多方面的支持。肝硬化病人经过一定的时间可发展成肝癌。目前认为肝癌的发病是个多因素、多步骤的复杂过程，受遗传和环境的双重因素影响，其中乙醇和乙肝病毒同为导致肝癌的重要因素。乙醛对动物有致癌性，它与人类肿瘤也有关联。乙醛在体内有效剂量和作用时间长短除与饮酒量和饮酒频率相关外，主要与其代谢酶ADH和ALDH的代谢能力高低有关。
　　乙醇脱氢酶（ alcohol dehydrogenases， ADHs）和乙醛脱氢酶（ aldehyde dehydrogenases，ALDHs）是体内参与乙醇代谢的最重要的酶类。乙醇先经ADH代谢为乙醛，乙醛进一步经 ALDH代谢为乙酸。肝脏是乙醇代谢的最重要的器官，乙醇经胃和肠道吸收的乙醇经静脉进入刚脏，有80%~90%的乙醇在肝脏代谢。ADH和ALDH酶活性体内外均显示明显的个体差异。且有文献报道癌组织和正常组织两种酶的活性差异，如胰腺癌、食道癌[4]。
　　本研究拟以肝癌病人癌旁组织和正常的人肝标本为研究对象，考察两种肝组织总ADH、ADHI、ADHII及总ALDH、ALDH2酶活性差异及相关基因多态性对代谢酶活性的影响，以期找到肝癌的发病机制。
　　方法：
　　1、人肝标本
　　收集正常人肝标本74例（主要为肝血管瘤患者），年龄20～75岁（中位数为49岁）。男性和女性分别为25例和49例，有吸烟史和饮酒史的分别为8例和7例。肝癌癌旁组织68例，年龄29～75岁（中位数为52岁）。男性和女性分别为10例和58例，有吸烟史和饮酒史的分别为30例和22例。本试验方案经郑州大学医学伦理委员会批准，受试者签署知情同意书。
　　2、 ADH和ALDH的基因分型
　　采用DNA提取试剂盒从肝组织中提取基因组DNA。其中ADH1B rs1229984（G>A）及ADH1Crs698（A>G）是通过PCR-RFLP方式确定其基因型。ADH1C rs2241894（A>G）、ALDH2 rs671（A>G）及ALDH2 rs13306164（C>T）是MassARRAY分子量阵列技术（Sequenom MassARRAY）确定受试者的基因型。
　　3、人肝匀浆的制备
　　采用离心法制备人肝匀浆，Bradford法测定肝微粒体蛋白含量。
　　4、总ADH、ADHI、ADHII及总ALDH、ALDH2酶活性的测定
　　分别以亚硝基二甲基苯胺（p-nitrosodimethylaniline，NDMA），4-甲氧基-1-萘甲醛（4-methoxy-1-naphthaldehyde），6-甲氧基-2-萘甲醛（4-methoxy-2-naphthaldehyde），6-甲氧基-2-萘甲酸，乙醛为总ADH、ADHI、ADHII，总ALDH、ALDH2的底物，加入相应的辅酶（NAD或NADH），肝匀浆上清，缓冲液，通过荧光或紫外的方法在一定波长下检测相应物质的吸收。通过计算单位时间内吸光值的变化值，并除以相应的蛋白浓度即可得到转化率的值。
　　5、统计方法：
　　采用SPSS17.0统计软件对各项数据资料进行统计学分析。酶活性数据进行正态性检验，对于非正态分布的，采取非参数检验进行相关分析。检验水准α为0.05。
　　结果：
　　1、肝匀浆上清总蛋白含量
　　肝癌癌旁组织肝匀浆上清的总蛋白含量中位数和范围分别为81.68(45.04-107.60)mg/g liver，而正常肝脏组为89.04(40.48-114.08) mg/g liver，肝癌癌旁组织肝匀浆上清的总蛋白含量显著低于正常肝组织。
　　2酶活性
　　2.1、正常肝标本总ADH、ADHI、ADHII及总ALDH、ALDH2酶活性
　　正态性检验结果表明，人肝匀浆总ADH、ADHI、ADHII及总ALDH、ALDH2酶活性参数呈非正态分布，因此本实验采用非参数检验进行统计分析。74例人肝人肝匀浆总ADH、ADHI、ADHII及总ALDH、ALDH2酶活性中位数和范围分别为1.81（0.16~72.12）、0.44（0.09~1.26）、0.18（0.03~0.53）、0.12（0.01~0.31）、9.21（0.85~18.35） pmol·min-1·mg-1protein；差异倍数分别为447.9、14.4、16.0、21.0、21.6倍。结果显示，总ADH、ADHI、ADHII及总ALDH、ALDH2酶活性呈现出较大的个体差异性。
　　2.2、肝癌癌旁标本总ADH、ADHI、ADHII及总ALDH、ALDH2酶活性
　　正态性检验结果表明，肝癌癌旁组织肝匀浆总 ADH、ADHI、ADHII及总ALDH、ALDH2酶活性参数呈非正态分布，因此本实验采用非参数检验进行统计分析。74例人肝人肝匀浆总ADH、ADHI、ADHII及总ALDH、ALDH2酶活性中位数和范围分别为8.14（1.23~43.07）、1.68（0.73~7.10）、0.53（0.14~1.66）、0.15（0.03~0.34）、9.40（1.45~50.18） pmol·min-1·mg-1protein；差异倍数分别为35.0、9.8、11.5、12.9、34.7倍。结果显示，总ADH、ADHI、ADHII及总ALDH、ALDH2酶活性呈现出较大的个体差异性。
　　2.3、正常及肝癌癌旁标本总ADH、ADHI、ADHII及总ALDH、ALDH2酶活性差异
　　肝癌癌旁标本总 ADH、ADHI、ADHII酶活性较正常肝标本活性明显升高（p<0.000）；肝癌癌旁组织总ALDH酶活性较正常肝标本以pmol/min/mg protein为单位时明显升高，但以pmol/min/g liver为单位时不具有统计学意义，ALDH2酶活性在两组标本中没有差异。
　　3、相关酶基因多态性及对活性的影响
　　3.1、正常肝标本基因多态性结果及对基因多态性对酶活性的影响
　　ADH1B rs1229984（G>A）的突变频率为29.7%，ADH1C rs698（A>G）的突变频率为10.5%，ADH1C rs2241894（G>A）的突变频率为26.9%。总ADH、ADHI、ADHII酶活性在AA、AG、GG三组中都无显著的差异性。结果显示，在正常肝组织中ADH突变对人肝ADH酶的代谢活性无明显影响。
　　ALDH2 rs671（A>G）的突变频率为87.3%，ALDH2 rs13306164（C>T）的突变频率为2.2%。对于ALDH2 rs671（A>G）突变，突变体GA总ALDH酶活性较野生型低；对于ALDH2 rs13306164（C>T）突变，突变体TC总ALDH活性及ALDH2酶活性较野生型高。结果显示，在正常肝组织中ALDH突变对人肝ALDH酶的代谢活性有明显影响。
　　3.2、肝癌癌旁标本基因多态性结果及对基因多态性对酶活性的影响
　　ADH1B rs1229984（G>A）的突变频率为38.1%，ADH1C rs698（A>G）的突变频率为9.7%，ADH1C rs2241894（G>A）的突变频率为28.4%。ADH1B rs1229984 GG突变纯合子、ADH1C rs698 AG突变杂合子及ADH1C rs2241894 AG，AA突变体总ADH酶活性较野生型纯合子活性明显降低。
　　ALDH2 rs671（A>G）的突变频率为85.1%，ALDH2 rs13306164（C>T）的突变频率为5.2%。对于ALDH2 rs671（A>G）突变，突变体GA总ALDH活性及ALDH2活性较野生型低，ALDH2 rs13306164 C>T的突变对ALDH活性及ALDH2酶活性没有影响。
　　3.3、正常及肝癌癌旁标本基因多态性分布的差异
　　ADH1B rs1229984（G>A）、ADH1Crs698（A>G）、ADH1C rs2241894（G>A）、ALDH2 rs671（A>G）、ALDH2 rs13306164（C>T）基因多态性在正常及肝癌癌旁标本中分布没有差异。
　　结论：
　　1．人肝总 ADH、ADHI、ADHII及总 ALDH、ALDH2酶活性呈现出了较大的个体差异。
　　2．肝癌患者癌旁组织总ADH、ADHI、ADHII酶活性明显比正常肝标本相应酶活性高，可能是导致肝癌的发生的因素。
　　3．ADH及ALDH基因多态性在正常人和肝癌病人中分布没有差异。
　　4．ALDH2 rs671（A>G）及ADH1B rs1229984（G>A）、ADH1C rs698（A>G）、ADH1C rs2241894（G>A）影响乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性。

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中英文对照缩略词表

前言

材料与方法

1 实验材料

1.1 药品与试剂

1.2 仪器

1.3 肝脏标本

2 实验方法

2.1 ADH1B rs1229984(G>A)，ADH1Crs698(A>G)基因多态性的测定

2.2 人肝匀浆上清的制备与蛋白浓度的测定

2.3 总ADH、ADHI、ADHII及总ALDH、ALDH2酶活性的测定

3 统计分析

结果

1 ADH1B、ADH1C、ALDH2、ALDH2基因多态性

1.1 ADH2(rs1229984)和ADH3(rs698)PCR扩增产物及酶切后电泳图

1.2 正常肝标本基因多态性发生频率

1.3 肝癌癌旁组织基因多态性发生频率

2 酶活性

2.1 肝匀浆蛋白含量

2.2 酶活性

3 基因多态性对酶活性的影响

3.1 正常肝标本基因多态性对酶活性的影响

3.2 肝癌癌旁标本基因多态性对酶活性的影响

4 影响酶活性的因素

4.1 人口学及环境因素

4.1 基因型内个体差异

讨论

结论

参考文献

综述:乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶及与癌症的关系

个人简历及在研期间发表论文

致谢