志贺菌中CRISPR/Cas系统与其耐药关系的探讨

摘要

志贺菌性痢疾是全球面临的重要公共卫生问题，尤其是发展中国家的重要传染病之一。其病原体志贺菌属是一类具有高度传染性、危害较严重的革兰阴性肠道致病菌，且其不断增加的耐药性问题为志贺菌性痢疾的有效治疗增加困难。而耐药基因的水平转移作为细菌获得性耐药的一个重要方式已引起广泛关注。近年来人们发现成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPRs）与其相关基因序列(cas)编码的Cas蛋白组成的CRISPR/Cas系统作为原核生物的获得性和可遗传性的新型微生物防御系统，广泛存在于古细菌和细菌基因组中，可以有效抵抗噬菌体感染及质粒接合转移，限制外源性遗传物质的水平转移。这或许可以为解决细菌耐药性的传播提供帮助和新思路。但是目前CRISPR/Cas系统与细菌耐药关系的研究不多且未达成统一结论，机制尚不清楚。基于本课题组前期的研究进展，进一步研究志贺菌耐药与CRISPR/Cas系统的关系。
　　方法:
　　1.采用琼脂稀释法测定志贺菌最低抑菌浓度(MIC)。
　　2.应用PCR扩增，核酸序列分析志贺菌CRISPR/Cas系统相关位点。
　　3.应用电穿孔法使敏感志贺菌获得耐药质粒使其耐药、次抑菌浓度氯霉素并倍增浓度法诱导敏感志贺菌耐药、多耐药志贺菌无抗生素压力连续传代后，应用Clustal X2.1、Seqman、CRISPR Finder等分析CRISPR/Cas系统的变化。
　　4.应用CRISPR Target和BLAST寻找spacer的同源质粒和噬菌体，根据登记号在 NCBI或 GenBank中寻找目标质粒或噬菌体上的耐药信息；应用Bioedit软件寻找GenBank中志贺菌的耐药信息，本实验室保存的临床分离的志贺菌的耐药基因前期已用PCR方法检测。
　　结果:
　　1.志贺菌mel-sf1998024/zz经耐药质粒PHSG398电转化后CRISPR/Cas的各相关点均未见改变，志贺菌mel-sf2005127/hn的转化子的cse2位点经电转化后有IS600插入，余均未见改变。
　　2.三株志贺菌经氯霉素诱导耐药后对不同抗生素的敏感性均有不同程度的降低；CRISPR/Cas系统的各相关位点均未见改变。
　　3.四株耐药谱不同的志贺菌经无抗生素压力传90代后对某些抗生素的敏感性有不同程度的增加；志贺菌mel-sf1998024/zz和mel-sf2013004/bj经无抗生素压力传代后CRISPR3位点的3’端的重复-间隔序列丢失；其余均未见改变。
　　4.数据库及临床分离的志贺菌中共52条spacer，其中有7个spacer与4个携带耐药基因的质粒同源；志贺菌的spacer同源的质粒与该志贺菌耐药信息分布存在相似性：间隔序列CRISPR2-mel-3同源的质粒pUMNF18_IncFV及携带该间隔序列的志贺菌mel-ss1998011/zz、mel-ss1998024/zz、mel-sf2005082/sx、mel-sf2013004/bj均发现含有相同的耐药基因blaTEM、aadA2和dfrA12，间隔序列CRISPR-Q1-S1、CRISPR-Q4-S1同源的质粒pM5A24P及该间隔序列所在志贺菌 sd1012中均发现携带有耐药基因 ampC和tetB；间隔序列CRISPR3-mel-33同源质粒 plasmid:5与该间隔序列所在志贺菌mel-sf2000102/zz均携带相同的耐药基因ampH、mrdA，进一步研究发现二者均携带毒力相关基因yafO、yafN、virK、ldrB、ychO，同时在该质粒上发现I-F型CRISPR/cas系统的存在。
　　结论:
　　1.在电转化入耐药质粒的条件下，志贺菌的CRISPR/Cas系统可能并不发挥相应功能。
　　2.高浓度的氯霉素可能会激活志贺菌外输泵蛋白使细菌对抗生素产生耐药；氯霉素的抗生素压力可能并不对CRISPR/Cas系统产生影响。
　　3.志贺菌在无抗生素压力下可降低或丢失对某些抗生素的耐药性；志贺菌中CRISPR3位点的结构存在动态变化的过程，且CRISPR3位点与cas基因可能存在共进化。
　　4.在最初获得新的间隔序列时，外源遗传物质的其他基因片段如耐药基因可能也可整合到基因组中；CRISPR/Cas系统可能实现对耐药和毒力的共调控；CRISPR/Cas系统亦存在于质粒上。

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英文摘要

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英文缩略词

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 研究技术路线

3 结果

3.1 电转化敏感志贺菌耐药的变化

3.2 氯霉素诱导敏感志贺菌耐药前后CRISPR/Cas系统的变化

3.3 多耐药志贺菌无抗生素压力传代前后CRISPR/Cas系统的变化

3.4 志贺菌间隔序列同源质粒的耐药信息与其耐药的关系

4 讨论

4.1 电转化敏感志贺菌耐药前后CRISPR/Cas系统的变化

4.2 氯霉素诱导敏感志贺菌耐药前后CRISPR/Cas系统的变化

4.3 多耐药志贺菌无抗生素压力传代前后CRISPR/Cas系统的变化

4.4 志贺菌间隔序列同源质粒的耐药信息与其耐药的关系

5 结论

参考文献

附录

综述: CRISPR/Cas系统与细菌耐药关系的研究概况

个人简历

致谢