去泛素化酶抑制剂P5091引起食管鳞癌细胞凋亡的机制研究

摘要

蛋白质去泛素化是指由去泛素化酶(deubiquitinases，DUBs)介导的蛋白质泛素化的负向调节过程。泛素和去泛素化调节的动态平衡,影响或者调节细胞的生长、发育、信号转导、等许多细胞生理病理过程。去泛素化酶通过水解底物蛋白质上的泛素链调控蛋白的稳定性，其活性直接影响细胞内多种蛋白的周转率、活性、再生以及定位。P5091属于泛素特异性蛋白酶7(ubiquitin-specific protease7,USP7)的噻吩类抑制剂，能高度特异性抑制 USP7酶的活性，并且在多发性骨髓瘤的治疗中显示良好的抗肿瘤效果，对万珂、多柔比星等耐药的多发性骨髓瘤细胞也具有抑制作用。此外， P5091抑制结肠直肠癌细胞的增殖和诱导凋亡。然而，P5091在食管鳞癌中的作用及分子机制仍需进一步研究。
　　本文主要通过体外实验来研究P5091在食管鳞癌中作用及机制，评价P5091对食管鳞癌增殖、凋亡、克隆形成等的作用，进一步利用 siRNA技术沉默靶基因的表达来反向验证P5091对食管鳞癌细胞的作用，阐明P5091在食管鳞癌细胞中作用的具体分子机制，为食管鳞癌治疗的新药开发提供理论基础，为今后P5091应用于临床食管鳞癌的治疗提供理论基础。
　　方法：
　　1. USP7在食管鳞癌中的表达水平检测：取多株食管鳞癌细胞系和食管癌组织芯片进行USP7蛋白水平的检测，选取有代表性的细胞系为本实验所用细胞系：KYSE450、KYSE510、KYSE30。
　　2.药物浓度筛选：通过 ATP依赖的荧光素酶细胞活性检测来计算在不同细胞系中P5091的IC50值，从而确定不同细胞系的实验药物浓度。
　　3.平板克隆形成实验和细胞形态学图片分析：评价不同浓度的P5091对食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的增殖抑制效应。
　　4.细胞凋亡检测：用AnnexinV-FITC和 PI染色检测不同浓度的P5091对食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30凋亡的影响。
　　5. Caspasae-3的激活情况：用FITC-DEVD-FMK染色法检测Caspase-3激活情况；Western Blot检测P5091作用后食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的c-PARP和c-caspase-3的表达情况。
　　6.P5091对抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白的影响：Western Blot检测P5091作用后食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30中抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白的变化，本实验中Noxa发生明显变化。
　　7. P5091对Noxa mRNA水平的影响：用Q-PCR的实验方法测定P5091处理食管鳞癌细胞后不同时间点促凋亡蛋白Noxa的mRNA水平变化。
　　8. Noxa在P5091诱导细胞凋亡中的作用：对Noxa基因沉默后通过流式细胞术来检测不同浓度P5091引起的食管鳞癌细胞凋亡率的变化。
　　9.转录因子4（Activating transcription factor4，ATF4）上调Noxa：同时对Noxa和调节Noxa基因表达的上游调控分子ATF4进行基因沉默，通过流式细胞术检测不同浓度P5091引起的细胞凋亡率的变化。用Western blot的方法检测对Noxa、 ATF4基因沉默后凋亡标志性蛋白c-PARP蛋白水平的变化。
　　结果：
　　1. P5091抑制食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的增殖ATPlite实验、平板克隆以及形态学观察的实验结果显示，P5091可以明显抑制食管鳞癌细胞增殖，并且呈浓度依赖性。
　　2. P5091诱导食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30发生凋亡流式细胞术检测结果表明不同浓度 P5091引起食管鳞癌细胞发生明显的凋亡，总凋亡率随药物浓度增加而升高。同时Western blot实验结果表明：细胞凋亡标志性蛋白c-PARP和c-caspas3的表达增加，并且随着药物浓度增加而增高。3. P5091通过促进促凋亡蛋白Noxa的表达来诱导食管鳞癌细胞的凋亡
　　Western Blot结果显示，P5091处理后Noxa蛋白水平明显增高。Q-PCR结果显示： P5091处理后在不同的时间点食管鳞癌细胞中Noxa的mRNA水平均有明显升高。对食管鳞癌细胞进行Noxa基因沉默后，不同浓度P5091引起食管鳞癌细胞的总凋亡率与Noxa基因敲除前相比明显降低，且c-PARP蛋白水平也明显降低，提示Noxa可能是P5091作用的关键分子。
　　4. P5091诱导食管鳞癌细胞发生内质网应激（ERS）
　　Western blot结果显示P5091处理后ERS的标志性蛋白p-EIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平明显增高，提示P5091诱导食管鳞癌细胞发生ERS。
　　5. P5091通过上调ATF4，进而引起Noxa积聚，最终诱导细胞凋亡
　　Western blot结果显示P5091处理后ATF4和Noxa蛋白水平明显升高，且流式结果提示P5091诱导细胞凋亡。同时，Q-PCR结果提示P5091也上调了Noxa的mRNA水平。为了进一步探究Noxa是否是受ATF4调控，我们进行Noxa和ATF4的基因沉默实验。结果提示：RNA干扰沉默ATF4后，P5091引起的细胞凋亡率明显降低，c-PARP和Noxa蛋白水平明显降低，提示ATF4很可能是P5091引起食管鳞癌细胞凋亡中Noxa积聚的主要调节因子。
　　结论：
　　1. P5091显著抑制食管鳞癌细胞的增殖。
　　2. P5091通过ERS上调ATF4的表达，促进Noxa的表达，进而引起食管鳞癌细胞凋亡。

目录

声明

英文缩略词表

引言

1 实验材料

1.1 细胞系

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

1.4 主要试剂的配制

1.5平板克隆所用试剂

2 实验方法

2.1 细胞培养

2.2细胞的增殖抑制实验

2.3细胞的形态学分析

2.4平板克隆形成实验

2.5 流式细胞术

2.6免疫组织化学

2.7Western Blot实验

2.8 Real TimeQ-PCR实验

2.9 si RNA干扰实验

2.10统计学分析

3.实验结果

3.1USP7在食管鳞癌细胞系及组织中的表达情况检测

3.2 P5091抑制食管鳞癌细胞增殖

3.3 P5091抑制食管癌细胞克隆形成能力

3.4 P5091诱导食管鳞癌细胞发生凋亡

3.5 P5091通过上调Noxa的表达诱导食管鳞癌细胞凋亡

3.6 P5091引起内质网应激

3.7 P5091引起ATF4上调进而增加促凋亡蛋白Noxa的表达，促进细胞凋亡

4 讨论

参考文献

综述:去泛素化酶USP7抑制剂在肿瘤治疗中的研究意义

个人简历