LSD1介导雌激素及雄激素受体信号对胃癌转移调控作用的机制研究

摘要

组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶（Histone Lysine Specific Demethylase LSD1）是在2004年Shi Yang教授课题组首次发现并在多个肿瘤细胞中证实有高表达的一个赖氨酸特异性去甲基化酶。ERα（Estrogen Receptorα）和AR （Androgen Receptor）作为激素相关的受体其靶基因转录的研究主要集中在其靶器官，如乳腺癌和前列腺癌等。E2作为ERα受体的配体可以激活ERα，同时DHT作为AR受体的配体可以激活AR从而激活下游的靶基因。课题组前期实验结果发现，LSD1敲除后对胃癌细胞MGC 803对雌鼠和雄鼠的肺转移产生了不同的影响。因此，本文旨在研究LSD1是否介导雌激素及雄激素受体信号对胃癌转移调控的作用。 ⑴胃癌病人组织中LSD1和ERα以及AR的表达及相关性研究 已有多篇文献报道LSD1在各个癌症包括胃癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤中高表达，且LSD1的高表达在各个癌症病人中显示着低愈后的效果，而胃癌的发病率在性别上有明显的不同。通过以上现象和结论，我们选取146例不同性别病人的肿瘤组织和癌旁组织进行免疫组织化学分析，进行LSD1和ERα以及AR免疫组化染色，并通过Pearson检验进行相关性分析。实验结果表明，在胃癌病人组织中，LSD1和AR的蛋白表达在癌组织中高于癌旁组织，而ERα的蛋白表达在癌旁组织中更高，且LSD1和ERα的表达量有明显的负相关。 ⑵探索在两种胃癌细胞中E2、DHT对LSD1的影响 在本课题的前期工作中发现LSD1和ERα可能存在一个负调控，在多篇文献中表明，LSD1可和ERα以及AR形成复合物对ERα以及AR下游靶基因的转录有一定的调控作用。E2作为ERα受体的配体可以激活ERα，同时DHT作为AR受体的配体可以激活AR从而激活下游的靶基因。因此，本章节旨在研究E2、DHT对LSD1是否有一个调控作用以探索ERα与LSD1之间的关系。 通过在MGC 803细胞中加入不同浓度的的E2刺激，经过48小时之后利用Westernblot检测LSD1的表达量，发现在MGC 803细胞中，E2可以下调LSD1的表达量，而加入ERα的抑制剂MPP后MPP可以抑制E2对LSD1的调节，表明E2对LSD1的调节是通过LSD1来实现的；在SGC 7901细胞中发现相同的实验结果。 通过在MGC 803细胞中加入不同浓度的的DHT刺激，经过48小时之后利用Westernblot检测LSD1的表达量，发现在MGC 803细胞中，DHT可以上调LSD1的量，而加入AR的抑制剂BIC后可以抑制DHT对LSD1的调节，表明DHT对LSD1的调节是通过LSD1来实现的；在SGC 7901细胞中也得到了验证。 ⑶E2、DHT通过相应的激素受体对细胞的增殖、侵袭及转移的调控研究 在慢病毒载体构建的敲低LSD1表达的MGC 803 LSD1 KD细胞和过表达LSD1的MGC 803 LSD1 OE细胞系和正常的胃癌细胞MGC 803细胞中，通过加入不同浓度的E2和DHT之后检测发现并不影响MGC 803细胞的增殖，把LSD1 KD或者OE后几乎也没有影响。在SGC 7901、MKN 45和MKN 7细胞中用同样的实验方法检测发现E2和DHT并不影响其细胞的增殖。 在MGC 803、SGC 7901、MKN 45以及MKN 7细胞中加入E2通过划痕实验检测发现E2可抑制这几株胃癌细胞的迁移；加入DHT检测发现DHT可以促进这几株胃癌细胞的迁移。 在MGC 803细胞中加入E2通过Transwell实验检测发现E2可以抑制MGC 803细胞的转移，但是加入雌激素受体抑制剂MPP可以抑制E2对MGC 803细胞的转移作用，在SGC 7901、MKN 45以及MKN 7细胞中有相同的结果；而在MGC 803细胞中加入DHT通过Transwell实验检测发现DHT可以促进MGC 803细胞的转移，加入雄激素受体抑制剂BIC之后发现BIC可以抑制DHT对MGC 803细胞的促转移作用，同样在另外三株细胞中发现了相同的结果。 在MGC 803细胞中加入E2通过免疫荧光（IF）实验检测发现E2降低EMT标志蛋白中N-cadherin的表达，上调E-cadherin的表达；通过Western blot 检测EMT信号标志蛋白的表达变化，结果发现加入E2可以上调上皮标志蛋白的表达而抑制间质标志蛋白的表达；加入DHT检测发现了相反的结果。相同的实验结果在SGC 7901、MKN 45、MKN7细胞系中同样检测到。实验结果表明E2抑制胃癌细胞的转移，而DHT可以促进胃癌细胞的转移。 ⑷E2对ERα以及LSD1调控的机制研究 在多篇文献中表明，LSD1作为AR和ERα的共激活复合物的成员调控着AR、ERα下游靶基因的转录激活。在MGC 803细胞中加入E2通过免疫共沉淀（IP）实验和免疫荧光（IF）检测发现E2可以增加ERα和LSD1的结合，相同的实验结果在SGC 7901、MKN 45及MKN 7细胞中同样检测到。在MGC803细胞中使用脂质体2000（Lippfectamine? 2000，Lipo2000）和脂质体3000（Lippfectamine? 3000，Lipo3000）将构建好的LSD1 siRNA和萤火虫荧光素酶质粒ERE-Luciferase和海肾荧光素酶质粒SV-40加入E2通过荧光素酶报告基因实验检测发现E2激活ERα活性区域ERE的转录，而LSD1 KD后抑制了ERE的转录活性。相同的实验结果在SGC 7901、MKN 45、MKN7细胞系中同样检测到。 通过在MGC 803细胞以及稳定表达的MGC 803 LSD1 KD细胞中提取细胞的总RNA 用RT-qPCR的实验方法检测到E2可不同程度的激活ERα和LSD1共同调节的下游靶基因转录的转录，且将LSD1 KD后各个基因的mRNA水平都低于正常的MGC803细胞。说明LSD1影响了胃癌细胞MGC 803中E2对ERα和LSD1共同调节的下游靶基因的转录。 通过在MGC 803细胞中用LSD1的IP复合物检测对LSD1底物活性的影响，结果发现H3K9me2的蛋白表达量增加，表明LSD1和ERα形成复合物后明显的抑制了LSD1的活性，当加入E2刺激后的LSD1的IP复合物检测底物活性发现E2增加了LSD1的复合物对LSD1活性的抑制作用。

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