甲烷氧化菌分离鉴定及其对煤样中甲烷降解能力的研究

摘要

甲烷是煤矿瓦斯、煤层气的主要成分，CH4爆炸极限是4.5-16％，易燃易爆。煤矿瓦斯气体是影响采煤安全作业的重要因素，在开采煤矿过程中瓦斯气体释放，在井下大量积累，是煤矿事故发生的重要因素之一。目前主要是采用巷道通风，抽放等物理手段处理煤矿瓦斯，但由于煤层地质构造复杂，煤层透气性差，煤矿瓦斯灾害很难得到彻底的治理。甲烷氧化菌具有分解利用甲烷的能力，为解决煤矿瓦斯问题提供了新的方向。若能在煤层开采作业面或煤层中利用甲烷氧化菌降低甲烷含量是值得探索的新途径。甲烷氧化菌氧化甲烷的活性受外界条件影响较大，对环境温度、压力和氧敏感，以及在含瓦斯的煤层中，甲烷是与煤以一种结合态的形式存在的，这些问题都是利用甲烷氧化菌治理瓦斯气体面临的重要技术难题。因此筛选高活性、适应能力强的甲烷氧化菌菌株、探明甲烷氧化菌吸收和利用煤层中结合态甲烷的能力是开展微生物治理瓦斯气体危害的基础性工作。本研究在甲烷氧化菌筛选、煤样中甲烷的微生物降解等方面开展了如下研究工作。
　　从新乡卫河、牧野湖等采集土壤样，经过富集培养、分离得到3株甲烷氧化菌，分别是AEM1204、AEM1235、AEM1296菌株。控制甲烷为唯一碳源对其进行气相色谱鉴定，其中AEM1235利用甲烷能力最强。对pH、温度等培养条件优化，AEM1235菌株最适的培养基和培养条件为:甲烷氧化细菌培养基(g/L)∶NH4Cl0.5，K2HPO40.4，KH2PO4·7H2O0.4,MgSO4·7H2O0.3,CaCl2·2H2O0.02,KNO31.6;NaCl0.3,EDTA0.02,FeSO4·7H2O0.004,CuSO4·5H2O0.0013,MnSO4·H2O0.004,ZnSO4·7H2O0.00034,NaMoO4·2H2O0.0024，pH为7.0，培养温度为30℃，气相充入氧气∶甲烷=1∶1的混合气体。此外甲烷氧化菌AEM1235也能利用甲醇作为唯一碳源生长，生长速率高于CH4作为唯一碳源。因此在大量培养该甲烷氧化菌时，先用甲醇培养获得生物量，再充入CH4提高其氧化甲烷的活性。
　　对AEM1235菌株进行形态观察和生理生化分析，该菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，菌落呈圆形，大小0.5-1mm、半透明的灰白色、边缘整齐。能够利用甲醇、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉等。接触酶试验、柠檬酸盐利用试验、硫化氢产生试验、淀粉水解试验、明胶液化试验为阳性;吲哚试验、甲基红试验则为阴性。经16SrDNA序列分析，对序列进行同源性比对，发现AEM1235的16SrDNA序列与嗜甲基生丝微菌属（AB680579.1Hypromicrobiummethylovorumg）关系最紧密。测定其生长情况，表明在甲烷为唯一碳源条件下AEM1235菌株生长较慢，培养8d后达到最大生长量，因此对于后续煤样中甲烷氧化试验的培养物选用7-8d的培养物。
　　取培养7-8d的AEM1235培养物平板菌落计数并调整细胞浓度为为1.0×108cfu/ml，用于煤样中甲烷的氧化实验。在煤样中加入甲烷氧化菌菌悬液，抽气后分别充入CH4与O2的1∶1混合气体、纯CH4气体进行等温吸附实验，气相色谱测定放出气体体积和其中各种成分的含量。结果表明不加甲烷氧化细菌的煤样进行的甲烷气体的吸附与脱吸附实验气体中的甲烷量没有变化。充入CH4与O2的1∶1混合气体，气体中甲烷含量和氧浓度明显降低，表明甲烷氧化菌对甲烷具有吸收和利用的能力，即在高压有氧条件下煤样中的甲烷被氧化。在充气压强为5MPa、接种量12.5％条件下，CH4与O2消耗量之比为1∶1.933，同时有少量CO2的生成,表明吸收的甲烷被氧化后主要以中间氧化物形式存在。
　　对吸附煤样充入纯的CH4气体，放出气体中甲烷含量和氧浓度同样有明显的降低、有CO2的生成，但甲烷和氧的消耗量均明显低于充氧条件下的消耗量，在12.5％接种量和充气压强5.0MPa条件下，吸收的甲烷量是充氧条件下的58％，但CO2的生成量明显高于有氧条件，表明甲烷氧化菌AEM1235在高压缺氧条件下对甲烷仍然具有吸收和利用的能力。上述结果提示我们，甲烷氧化细菌在地下煤层的高压和缺氧的条件下有可能具有吸收和氧化煤层中结合态CH4的能力。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 甲烷氧化菌

1．1．1 甲烷氧化菌的分类

1．1．2 甲烷氧化菌的生态分布

1．1．3 甲烷氧化菌的特征酶

1．1．4 甲烷氧化菌的代谢途径

1．1．5 甲烷氧化菌的基因工程改造与MMO的外源表达

1．1．6 甲烷氧化菌的应用研究与前景

1．2 甲烷氧化菌在煤矿瓦斯消除方面的研究与应用现状

1．3 选题依据、意义及主要研究内容

第二章 甲烷氧化菌的分离、鉴定与生长特性研究

2．1 主要试剂与仪器设备

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．2 培养基

2．3 试验方法

2．3．1 样品采集

2．3．2 甲烷氧化菌的富集培养

2．3．3 甲烷氧化菌的分离

2．3．4 形态观察

2．3．5 生理生化特征鉴定

2．3．6 分子生物学鉴定

2．3．7 甲烷氧化菌氧化甲烷能力测定

2．3．8 培养条件优化

2．4 结果与分析

2．4．1 甲烷氧化菌的筛选

2．4．2 AEM1235菌株甲烷氧化菌的鉴定

2．4．3 AEM1235甲烷氧化菌氧化甲烷能力测定

2．4．4 AEM1235的分子鉴定

2．4．5 AEM1235甲烷氧化菌培养条件优化

2．4．6 AEM1235菌株在液体培养基中的生长规律

2．5 结论

第三章 甲烷氧化菌对煤样中CH4的氧化能力与条件

3．1 材料与方法

3．1．1 实验仪器

3．1．2 实验设备

3．1．3 主要设备仪器标准体积的测定

3．1．4 煤样制备及工业分析

3．1．5 实验菌株的细胞培养

3．1．6 设备密封性检查

3．1．7 气体的等温吸附与脱吸附实验

3．2 结果与分析

3．2．1 研究技术路线

3．2．2 煤样采集

3．2．3 主要设备体积测定与煤样工业分析结果

3．2．4 煤样对CH4吸附特性

3．2．5 有氧气条件下甲烷氧化菌对CH4氧化作用

3．2．6 不充氧条件下甲烷氧化细菌对煤样中CH4的氧化作用

3．3 结论

参考文献

致谢

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