从转录组和蛋白组水平研究涡虫尾再生中细胞分化的途径和方式

摘要

涡虫具有很强的再生能力。从涡虫咽前部将涡虫横切为前后两段时，前段部分从伤口处再生出缺失的后段，包括表皮、肌肉和神经等，称为涡虫尾再生(PTR)。后段部分从伤口处再生出缺失的前段，包括表皮、肌肉、神经、“脑”和眼点等，称为涡虫头部再生(PHR)。成体涡虫再生与胚芽基细胞(neoblasts)密切相关。胚芽基细胞广泛分布于涡虫体内，通过迁移、增殖、分化等过程完成组织结构重建和涡虫再生。其中，细胞分化是涡虫尾再生的关键所在，其过程涉及多种基因/蛋白，了解其调节途径和方式，是揭示机理的必要环节。为此，本研究建立涡虫尾再生模型，用基因表达谱芯片定性、定量分析了涡虫术后0h、2h、6h、12h、24h、30h、36h、72h、120h和168h再生尾部的基因种类和表达丰度，根据基因表达丰度计算ratio值。发现8470种基因的ratio值大于对照3倍，称为上调基因;1940种基因的ratio值小于对照1/3倍，称为下调基因;657种基因在有的时间点上调/有的时间点下调，称为上/下调基因，三项合计11067种基因。为从蛋白质组水平研究PTR中细胞分化与组织器官重建机理，本研究建立PTR模型，并提取其蛋白质。用荧光差异双向电泳(DIGE)结合质谱检测(MS)定性、定量这些蛋白的种类和表达丰度，根据蛋白表达丰度计算ratio值。发现1062种蛋白上调，181种蛋白下调，151种蛋白上/下调，三项合计1394种蛋白。查GO注释表明，这些基因/蛋白涉及信号传导、细胞分化等33种生理活动。其中，560种基因和52种蛋白参与细胞分化信号通路，1985种基因和216种蛋白参与细胞分化。最后，用网络原理和方法解析基因/蛋白表达变化预示的生理活动(Ep(t)值)发现，涡虫尾再生中NF-κB、BMP和p70S6K通路的信号传导活动显著强于对照，其调节的表皮细胞分化活动也于相应时间显著强于对照，表明这些信号通路促进表皮细胞分化和表皮重建。另一方面，TGF-β通路的信号传导活动显著强于对照，其调节的肌肉和神经细胞分化活动也于相应时间显著强于对照，表明该通路促进肌肉和神经细胞分化以及肌肉和神经重建。同时，Wnt通路的信号传导活动显著强于对照，其调节的“脑”神经细胞和视觉细胞分化活动于相应时间显著弱于对照，表明该通路抑制“脑”神经细胞和视觉细胞分化以及“脑”和眼点重建。综上所述，NF-κB、BMP、p70S6K、TGF-β等四条通路通过调节细胞分化促进PTR的表皮、肌肉和神经重建，而Wnt通路抑制PTR的“脑”和眼点重建。本研究用生物高通量技术检测了涡虫尾再生中相关基因/蛋白的表达丰度，用生物信息学和系统生物学方法分析涡虫尾再生中相关基因/蛋白及其表达变化预示的生理活动强弱，用网络分析方法研究了涡虫尾再生中基因/蛋白的作用机理，为进一步探讨涡虫尾再生机理提供了资料。

目录

摘要

缩略语表

第一章 文献综述：涡虫再生研究

1 涡虫再生

2 涡虫再生的细胞来源

3 涡虫再生的细胞分化

4 涡虫再生的蛋白质组学研究

5 信号通路对细胞分化的调节作用

6 信号通路对涡虫再生的调节作用

7 研究目的和意义

8 研究方案和目标

参考文献

第二章 从基因转录组水平解析涡虫尾再生中表皮、肌肉、神经、“脑”和眼点形成的途径和方式

摘要

引言

1 材料与方法

1．1 日本三角涡虫的捕获、饲养

1．2 涡虫尾再生模型制备

1．3 基因芯片检测及数据整理

1．4 细胞分化相关基因的确认

1．5 细胞分化相关信号通路的确认

1．6 信号传导活动与细胞分化活动强弱的确认

1．7 信号传导活动与细胞分化活动的相关性分析

2 结果与分析

2．1 涡虫尾再生中有意义表达变化基因及其参与的生理活动

2．2 涡虫尾再生中表皮细胞分化与表皮重建

2．3 涡虫尾再生中肌细胞分化与肌肉重建

2．4 涡虫尾再生中神经细胞分化与神经重建

2．5 涡虫尾再生中“脑”神经细胞分化与“脑”重建

2．6 涡虫尾再生中视觉细胞分化与眼点重建

3 讨论

参考文献

第三章 从蛋白质组水平解析涡虫尾再生中表皮、肌肉、神经、“脑”和眼点形成的途径和方式

摘要

引言

1 材料与方法

1．1 已述及的材料与方法

1．2 涡虫尾再生的蛋白提取

1．3 蛋白的双向电泳(IEF／SDS-PAGE，2D)

1．4 荧光标记蛋白双向电泳(DIGE)与灰度扫描定量

1．5 蛋白的质谱测序和定性

1．6 细胞分化相关蛋白的确认

1．7 细胞分化相关信号通路的确认

1．8 信号传导活动与细胞分化活动强弱的确认

1．9 信号传导活动与细胞分化活动的相关性分析

2 结果与分析

2．1 涡虫尾再生中有意义表达变化蛋白及其参与的生理活动

2．2 涡虫尾再生中表皮细胞分化与表皮重建

2．3 涡虫尾再生中肌细胞分化与肌肉重建

2．4 涡虫尾再生中神经细胞分化与神经重建

2．5 涡虫尾再生中“脑”神经细胞分化与“脑”形成

2．6 涡虫尾再生中视觉细胞分化与眼点形成

3 讨论

参考文献

第四章 涡虫尾再生中细胞分化相关基因表达与蛋白表达的相关性

摘要

引言

1 材料与方法

1．1 已述及的材料与方法

1．2 蛋白表达的转录水平调控与翻译水平调控确认

2 结果与分析

2．1 涡虫尾再生中基因转录与蛋白表达的相关性

2．2 涡虫尾再生中基因转录与蛋白表达预示的生理活动相关性

2．3 涡虫尾再生中基因和蛋白的表达模式相关性

2．4 涡虫尾再生中基因和蛋白的聚类结果相关性

2．5 涡虫尾再生中细胞分化相关基因和蛋白的表达模式相关性

2．6 涡虫尾再生中细胞分化相关基因和蛋白的聚类结果相关性

2．7 涡虫尾再生中基因表达变化与蛋白表达变化预示的细胞分化信号通路的信号传导活动相关性

2．8 涡虫尾再生中基因表达变化与蛋白表达变化预示的细胞分化活动相关性

2．9 涡虫尾再生中基因表达变化与蛋白表达变化预示的信号通路对细胞分化的调节作用相关性

3 讨论

参考文献

总结与结论

1 总结

2 结论

致谢

攻读硕士学位期间参加的科研项目和已发表论文

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