黄河鲤体色发生观察及mitfa和tyr基因cDNA的克隆与组织表达研究

摘要

黄河鲤（Cyprinuscarpio haematopterus），隶属于鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，鲤属（Cyprinus），因其金鳞赤尾，肉质鲜美而闻名于世，同淞江鲈、兴凯湖鲐、松花江鳜被誉为我国四大淡水名鱼，是黄河流域主要的名贵优质鱼类之一。目前对于鱼类体色等方面的研究已经开展很多，主要集中于模式生物斑马鱼(Daniorerio)、青鳉（Oryzias latipes）或者一些观赏鱼上，但对黄河鲤体色的研究还相对较少。Mitfa基因是神经嵴细胞向黑色素细胞定向发育过程中最早的发生标志之一，并且其通过调控酪氨酸酶基因家族的表达来参与到黑色素细胞的分化和发育。Tyr作为酪氨酸酶基因家族的成员之一，是黑色素合成过程中的关键限速酶，其表达和活性决定黑色素生成的速度和产量。本文以黄河鲤为实验材料，选取黑色素合成通路中的关键基因mitfa和tyr作为研究对象，克隆得到mitfa和tyr基因的全长，研究两基因在黄河鲤各组织中的表达分布，并观察了黄河鲤体色的形成过程，检测两基因在体色形成各时期的表达，进一步探讨mitfa和tyr基因在鱼类体色形成中的作用。
　　本研究主要内容包括：⑴以黄河鲤黑色皮肤提取的总RNA作为模板，克隆得到mitfa基因cDNA全长(No.KT984198)，实时荧光定量分析其在8个组织中的表达情况，免疫组化方法检测其在两种不同颜色皮肤的表达及定位。结果显示:黄河鲤mitfa基因cDNA全长为1861 bp，包含1462 bp的开放阅读框，编码486个氨基酸，与锦鲤的相似性为95.7％。荧光定量结果显示mitfa在黄河鲤的8个组织中均有表达，并且在肌肉中的表达显著高于其它组织(P＜0.05)。免疫组化结果显示:Mitfa在黑色皮肤和银色皮肤中均有表达，并且在黑色皮肤中的表达比在银色皮肤中表达强烈。⑵以黄河鲤黑色皮肤总RNA为模板，RACE方法克隆tyr基因cDNA全长，实时荧光定量分析在11个组织中的表达情况，免疫组化方法检测两种不同颜色皮肤中的表达及定位。结果显示:黄河鲤Try基因cDNA全长1717bp(No.KY305667)，其中ORF长1605 bp，编码535个氨基酸，5'-UTR区41bp，3'-UTR区71 bp。蛋白同源分析发现黄河鲤Tyr与鲤科鱼类相似性最高，与哺乳类及鸟类等脊椎动物相似性最低。系统进化分析显示黄河鲤Tyr与锦鲤和斑马鱼等鲤科鱼类的亲缘关系最近。荧光定量结果发现tyr在黄河鲤不同组织中均有表达，肌肉中的表达量最高，之后是黑色皮肤，在银色皮肤中的表达量最低。免疫组织化学结果显示Tyr在黑色皮肤的黑色素细胞和粘液细胞中有表达，在银色皮肤没有表达。⑶观察描述了黄河鲤体色的发生过程，并对黄河鲤成鱼背部鳞片、腹部鳞片及鳍条的色素细胞的组成进行了观察。利用实时荧光定量PCR分析mitfa和tyr基因在黄河鲤体色形成过程中的表达情况。观察结果显示黄河鲤具有虹彩细胞、黄色素细胞和黑色素细胞三种色素细胞。对黄河鲤体色发生的观察显示，1 dph(1 days past hatch)在黄河鲤背部和腹部均有黑色素细胞;2dph时黄色素细胞出现，黑色素细胞数量增多;之后黑色素细胞和黄色素细胞数量逐渐增多直至遍布全身;31 dph～41 dph，虹彩色素细胞和鳞片开始出现。51 dph时体色基本形成。荧光定量结果显示:mitfa和tyr基因在黄河鲤体色形成各阶段均有表达，并且在51 dph达到最高。其中mitfa和tyr基因在黄河鲤体色形成过程中的表达趋势基本相同即随着黑色素细胞的增加而增加。

目录

摘要

缩略语中英文对照

第一章 前言

1．1 鱼类色素细胞

1．2 鱼类体色变异的分子遗传学机制

1．2．1 黑色素合成通路

1．2．2 体色相关基因的研究进展

第二章 mitfa基因的cDNA克隆与组织表达定位

2．1 实验材料

2．1．1 黄河鲤材料

2．1．2 实验设计

2．1．3 实验仪器

2．1．4 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 黄河鲤总RNA的提取

2．2．3 黄河鲤第一链cDNA的合成及中间片段扩增

2．2．4 黄河鲤mitfa基因的3’RACE

2．2．5 黄河鲤mitfa基因的5’RACE

2．2．6 PCR扩增产物的回收与纯化

2．2．7 胶回收产物与pMD-19T载体连接

2．2．8 胶回收产物的转化和阳性克隆的检测

2．2．9 序列拼接和分析

2．2．10 黄河鲤Mitfa蛋白的表达定位

2．2．11 黄河鲤各组织mitfa基因的表达分析

2．3 实验结果

2．3．1 黄河鲤黑色皮肤RNA的提取

2．3．2 黄河鲤mitfa基因中间片段的克隆

2．3．4 黄河鲤mitfa基因5’端扩增

2．3．5 黄河鲤mitfa基因的拼接及序列分析

2．3．6 黄河鲤Mitfa同源性和系统发生分析

2．3．7 黄河黑色皮肤和银色皮肤Mitfa蛋白的表达定位

2．3．8 黄河鲤mitfa基因组织特异性表达

2．4 讨论

第三章 黄河鲤tyr基因的cDNA克隆和组织表达定位

3．1 实验材料

3．1．1 黄河鲤材料

3．1．2 实验设计

3．1．3 实验仪器

3．1．4 实验试剂

3．2 实验方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 黄河鲤总RNA的提取

3．2．3 黄河鲤第一链cDNA的合成及中间片段扩增

3．2．5 黄河鲤tyr基因的5’RACE

3．2．6 PCR扩增产物的回收与纯化

3．2．11 黄河鲤各组织中tyr的表达分析

3．3 结果

3．3．1 黄河鲤黑色皮肤总RNA的提取

3．3．4 黄河鲤tyr基因5’端扩增

3．3．5 黄河鲤tyr基因的拼接及序列分析

3．3．6 黄河鲤Tyr的同源和系统发生分析

3．3．7 黄河皮肤组织Tyr蛋白的表达定位

3．3．8 黄河鲤tyr基因的组织特异性表达

3．3 讨论

第四章 mitfa及tyr在黄河鲤体色发生阶段中的表达分析

4．1 实验材料与方法

4．1．1 实验鱼

4．1．2 黄河鲤体色发生观察和样品采集

4．1．3 黄河鲤鳞片及鳍条色素细胞观察

4．1．4 黄河鲤体色发生阶段样品总RNA的提取

4．1．5 第一链cDNA的合成

4．2．1 黄河鲤体色发生观察

4．2．3 黄河鲤背部鳞片、腹部鳞片及鳍条色素细胞的观察

4．2．4 mitfa和tyr基因在黄河鲤体色形成中的表达

4．3 讨论

4．3．1 黄河鲤不同发育阶段的体色发生观察

4．3．2 mitfa和tyr基因在体色形成过程中的表达差异

参考文献

致谢

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附录

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